2014 Fiscal Year Research-status Report
培養シナプスモデルを用いた神経筋接合部の形態と機能に関わる分子メカニズムの解析
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26440080
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| Research Institution | University of Hyogo |
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Principal Investigator |
宮澤 淳夫 兵庫県立大学, 生命理学研究科, 教授 (60247252)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 神経筋接合部 / アセチルコリン受容体 / シナプス / 電子顕微鏡法 / 相関顕微鏡法 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ニコチン性アセチルコリン受容体（nAChR）は神経筋接合部（NMJ）のポストシナプスにおいて集積しており、その集積あるいはシグナル伝達に関わる様々な分子と共にクラスターを形成している。このクラスターの形態は、NMJの成熟や疾患により大きく変化する。本研究は、このクラスターの形態と機能に関わる分子メカニズムを解明する事を目的とする。今年度、分化C2C12筋管細胞上に、分化NG108-15神経細胞とそれと同細胞数のシュワン細胞を添加して３者共培養の検討を行い、1週間培養維持することに成功した。また、NMJの成熟度を判断するために、NMJに形成されるヒダ状形態を光学顕微鏡で観察する手法の検討も行った。nAChRと細胞膜の二重染色法を検討し、成熟したラット横隔膜のNMJにおけるヒダ状構造を可視化する方法を確立した。本手法によって観察した３者共培養１週目のNMJにはヒダ状構造は認められなかったが、シュワン細胞の添加によって共培養におけるnAChRクラスターの形成が促進され、３者細胞間において相互作用が起こっていることを確認できた。また、クラスター構成分子を光学顕微鏡および電子顕微鏡の両方で観察するための分子標識として、金属結合タンパク質であるメタロチオネイン(MT)、フィトケラチンのαアミノ酸アナログであるEC20、およびこれらを融合した標識MT-EC20について検討を行った。これら種々の遺伝的タグをマルトース結合タンパク質 (MBP)遺伝子に融合し大腸菌に導入した。標識に用いる元素には微結晶を形成すると蛍光を発することが知られているカドミウムイオンおよび亜セレン酸イオンを用いた。その結果、MBP-MT-EC20を発現している大腸菌において蛍光を検出することができた。さらに電子顕微鏡観察によって、大腸菌のペリプラズム空間で微結晶様構造物の存在を確認することができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の予定通り、神経細胞・筋細胞・シュワン細胞の３者を共培養する方法を確立できた。そして３者の細胞が同時に培養されているだけでなく、細胞間で相互作用することも確認できた。NMJに形成されるヒダ状構造を光学顕微鏡で観察するための方法も確立し、３者共培養におけるNMJの観察も行った。また申請者がこれまで開発していた遺伝的コード化標識法を改良し、さらに使用する添加元素を従来のカドミウムイオンのみから、カドミウムイオンと亜セレン酸イオンにすることで、細胞内で蛍光と微結晶様構造物を検出し、光学顕微鏡および電子顕微鏡の両方で観察できる分子標識法を確立することができた。本研究に関わる成果について３つの学会等で発表しており、おおむね順調に進展していると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
一年目に成功した３者共培養を長期間維持し、様々な成熟過程におけるnAChRクラスターの形態と、神経－筋シグナル伝達を解析し、クラスター形態と機能状態との関係を明らかにする。さらに、３者共培養あるいはC2C12細胞を用いて、nAChRクラスター構成分子を遺伝的標識法または免疫電顕法を用いてそれぞれ分子標識する。そして光学顕微鏡で蛍光観察した後、同じ細胞を電子顕微鏡で観察（相関観察）する。以上の結果を融合し、nAChRクラスターの形態や機能状態の変化と、クラスター構成分子の局在や細胞膜－細胞内膜間の動態、ならびに分子間相互作用との関係を明らかにする。nAChRクラスター構造を電子顕微鏡観察するために、従来の試料調製法に加えて、生きた状態に近い構造を観察することができるクライオ電子顕微鏡法を取り入れる。具体的には、試料の凍結超薄切片を作製してクライオ透過型電子顕微鏡で分子局在を明らかにする。ただし、観察が困難である場合は、クライオ走査型電子顕微鏡法による切削面観察も試みる。さらに、細胞膜に存在する膜タンパク質の観察には凍結割断レプリカ法を用いる。細胞全体やNMJ、nAChRクラスターの形態の観察は、凍結割断後の割断面を観察できるクライオ走査型電子顕微鏡法を用いて行う。さらに、培養シナプスモデルにおいてnAChRクラスター構成分子の遺伝子改変を行い、クラスターの形態および機能状態とクラスター内部の個々の分子局在への影響を明らかにする。加えてnAChRクラスターの形態や機能の異常が原因となる神経筋疾患のモデル動物を用いて、nAChRクラスターの形態およびクラスター構成分子の分布・局在・相互作用について相関顕微鏡法にて解析し、神経筋疾患の病態とnAChRクラスター構成分子の分子局在との関連を明らかにする。以上の結果をまとめ、NMJの機能と形態に関わる分子メカニズムの全貌解明を目指す。
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Research Products
(3 results)
