2014 Fiscal Year Research-status Report
ＥＧＦＲ天然変性ドメインの構造変化ダイナミクスの１分子ＦＲＥＴ計測
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26440088
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| Research Institution | The Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
岡本 憲二 独立行政法人理化学研究所, 佐甲細胞情報研究室, 専任研究員 (40402763)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | １分子計測(SMD) / 天然変性タンパク質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
平成２６年度の研究計画に従ってＥＧＦＲ分子の構造変化ダイナミクスの計測を進めていく中で、試料処理に関する問題点が明らかになった。これまで採用していた１分子計測データの中に、ガラス基板表面との非特異吸着により構造変化ダイナミクスに影響を受けている分子が含まれている可能性があることが分かった。そこで、ガラス基板の表面処理法を改善することとした。これまでの吸着性のブロッキング剤によるブロッキングに替え、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を化学結合させる方法を用いることにした。同時に、分子のガラス基板への固定法を、２次抗体を基板表面に吸着させる方式から、ＰＥＧの一部（１％程度）にビオチン修飾されたものを混在させ、ビオチン付きのＨｉｓ-タグ１次抗体とアビジンを介して固定する方式へと変更した。ＰＥＧを用いた基板表面修飾法にはすでにさまざまな方式が提案されているが、ブロッキング効率の高い方式を選定するために複数のプロトコルや試薬を試み、コンタミを減らすためのプロトコル最適化などをおこなってきた。その結果として、新たな表面処理法についてほぼ完成に至ることができた。
それと並行して、フォトンカウンティング検出器を備えたコンフォーカル顕微鏡装置と変分ベイズ-隠れマルコフモデル解析法を用いた１分子ＦＲＥＴ実験をおこなってきた。これらの手法は、研究計画で予定されていた高精度のダイナミクス計測を実現するためのものであるが、世界的にも実績が少ない手法であり、性能評価と経験の蓄積が必要であった。ホリデー・ジャンクションＤＮＡを対象として１分子ＦＲＥＴ計測実験をおこない、離散的な分子状態を識別し、エネルギー地形図を再構成することに成功した。これらの手法がＥＧＦＲの構造変化ダイナミクス計測においても有効であることが確認できた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
平成２６年度の研究計画に従ってＥＧＦＲ分子の構造変化ダイナミクスの計測を進めていく中で、試料処理に関する問題点が明らかになった。これまで採用していた１分子計測データの中に、ガラス基板表面との非特異吸着により構造変化ダイナミクスに影響を受けている分子が含まれている可能性があることが分かった。この問題を放置することは長期的な視野からも研究計画に与える影響が大きいと判断し、ダイナミクス計測実験より優先して、ガラス基板の表面処理法を改善することとした。そのため、本来予定していた実験を計画通りに進めることができなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
当初の研究計画と比べてやや遅れた分を含め、従来の研究計画に従って、ＥＧＦＲ構造変化ダイナミクス計測実験を進めていく。ＥＧＦＲ－ＣＴ分子では、天然型（ＷＴ）分子と疑似リン酸化変異体（ＰＭ）分子ではＦＲＥＴ分布が異なり、さらにＰＭ分子では溶液中にＧｒｂ２分子が存在することでＦＲＥＴ分布が変化することなどから、Ｇｒｂ２によって構造変化が誘起されることが考えられる。そこで、その過程のダイナミクスを直接観察することで、Ｇｒｂ２分子によるＥＧＦＲ分子構造およびそのダイナミクスへの影響を明らかにする実験に取り組む。また、ＥＧＦＲ-ＣＴ分子ではＧｒｂ２との相互作用により構造変化する部位が特定されていない。そこで、ＦＲＥＴラベル位置を変えた試料分子の計測結果を比較することにより、構造変化部位を特定する実験に取り組む。またこれまでに、Ｇｒｂ２によって誘起された構造変化は、時間とともに緩和することが示唆されている。そこで、Ｇｒｂ２によって構造変化を引き起こした後、溶液交換によってＧｒｂ２を溶液中から取り除く事で、構造緩和過程のダイナミクスを観察する実験もおこなう。
上の「９．研究実績の概要」で述べた、平成２６年度におこなったガラス基板処理の改善により、従来の問題点を解決できただけでなく、さらに実験の精度と効率を上げることが可能になり、これまでの遅れを取り戻して実験を進めていけると考えている。
これらの実験は、ＴＩＲＦ顕微鏡とＥＭ-ＣＣＤカメラによる高スループットのイメージング実験によって傾向を把握した後、コンフォーカル顕微鏡を用いた１分子ＦＲＥＴ計測と変分ベイズ-隠れマルコフモデル解析法の組み合わせによる高精度の計測をおこなうことで、ダイナミクスの詳細を明らかにしていく。
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| Causes of Carryover |
残金額が必要な物品の単価を下回ったため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
主に消耗品費として、次年度分予算と合わせて使用する。
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