2015 Fiscal Year Research-status Report
改良型TALENを用いた高効率ゲノム編集による細胞内物質輸送制御機構の解明
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26440108
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
池田 一穂 国立研究開発法人理化学研究所, 生命システム研究センター, 研究員 (20642565)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 細胞内物質輸送 / TALEN / 黒色素胞 / メラノソーム / キネシン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞内物質輸送は、細胞や組織の多岐に渡る生命機能を支える主要な機構の一つである。細胞内を輸送される小胞や細胞小器官の多くは、異なった運動特性を持つ複数種の分子モーターにより、しばしば細胞骨格上を双方向に輸送されるが、輸送方向の制御機構については未だ不明な点が多い。本研究課題は、主に魚類・両生類の黒色素胞をモデルシステムとし、細胞内物質輸送の輸送方向制御機構の解明を目指すものであり、当該年度は、微小管輸送の方向決定機構を説明する有力な仮説の一つである”綱引き”(Tug of War)仮説の細胞内での検証を行った。黒色素胞内のメラノソームは、ホルモン刺激に応答し、微小管上を双方向に輸送されるが、輸送を担う分子モーターの数制御や活性制御機構の詳細は分かっていない。そこで、任意のタイミングで外来性キネシン分子をメラノソームに局在させることができる実験系を確立し、メラノソーム上でキネシンとダイニンの単純な”綱引き”を実現したところ、このような双方向輸送は、異なった極性の分子モーター間の分子数の違いに由来する"綱引き"のみで制御され得ることを見出した。また他に、本課題で利用する主要な手法的アプローチの一つであるゲノム編集酵素TALENの改良・応用については、変異導入によるTALE蛋白質の構造変化や熱安定性の違い、及び標的配列に対する結合・乖離等の酵素特性を解析し、変異導入による活性化メカニズムの解明について一定の進展があった。更に、TALENの新規簡易構築法を確立した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ゲノム編集酵素TALENの改良・評価については予定通り進めることができた。申請時に立案した研究計画とは内容がやや異なるが、微小管上の細胞内輸送方向制御機構については、細胞内で異なる極性の分子モーター間の”綱引き”を実現することで、オルガネラの輸送方向制御機構の理解に貢献した。
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| Strategy for Future Research Activity |
本課題の立案時の計画通りに順次研究を進める。TALENを使ったKnock-inは当研究室において新しい手法が成果を上げており、本研究課題においてもこれを応用する。
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| Causes of Carryover |
消耗品の値段の変更等、予算使用計画に若干の変更が生じ、次年度使用額が小額発生した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度に予定している消耗品購入のための予算と合わせ使用する。
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