2014 Fiscal Year Research-status Report
脳原基の領域化と神経分化を統合的に制御する遺伝子ネットワークの解明
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26440114
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| Research Institution | Saitama University |
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Principal Investigator |
弥益 恭 埼玉大学, 理工学研究科, 教授 (60230439)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
川村 哲規 埼玉大学, 理工学研究科, 講師 (10466691)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | ゼブラフィッシュ / 脳形成 / 神経形成 / Notchシグナル / プロニューラルクラスター / 脳領域化 / Gbx2ホメオボックス遺伝子 / POU転写因子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
脊椎動物胚における脳領域化と神経分化を統合的に理解するため、ゼブラフィッシュを用いて以下に述べる一連の研究を行った。
１）ゼブラフィッシュ初期体節期胚の神経板におけるV型POU転写因子遺伝子pou2の発現を各種神経分化制御遺伝子（プロニューラル遺伝子、her、notch、deltaなど）の発現と2色WISHなどにより詳細に比較し、pou2の発現がプロニューラルクラスターとその周辺部で見られることを明らかとした。
２）転写抑制型Pou2の加温誘導性遺伝子en-pou2をゲノムに保有するトランスジェニック（Tg）魚Tg(hsp70l:en-pou2)を用いた実験により、pou2が、プロニューラル遺伝子（neurog1、ebf2）や神経分化途上にある前駆細胞マーカーdeltaのプロニューラルクラスターにおける発現を活性化する一方、神経分化抑制作用を持つNotch遺伝子notch1aとNotchシグナル下流でやはり神経分化抑制に働くher4.1の発現を低下させることを示した。
３）脳原基での神経分化におけるgbx2の働きを知るため、加温誘導性gbx2（hsp70l:gbx2）を保有するTg(hsp70l:gbx2)魚胚においてgbx2の強制発現を行い、定量的polymerase chain reaction法によって各種神経分化制御遺伝子の発現を検討し、gbx2がプロニューラル遺伝子（ebf2）の発現を活性化する一方でnotch1aを抑制することを示した。
４）以上の結果は、これまで中脳から後脳にかけて脳の領域化を行うとされてきたpou2とgbx2のいずれもが神経分化に促進的であることを示唆する。今回pou2とgbx2が相互に発現抑制することも見出しており、両遺伝子の神経板での発現はほぼ入れ子であることから、これらの遺伝子は神経分化制御の異なる局面に関与すると考えられる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまでにpou2及びgbx2と各種神経分化制御遺伝子の神経板における発現の検討をWISHで詳細に行い、実際にpou2とgbx2が、神経分化遺伝子の発現、プロニューラルクラスター、そして神経前駆体プールと密接な関係にあることを示した。蛍光ISH（FISH）を用いた発現比較についても部分的に成果を挙げつつあり、今後本格的に着手できる状態にある。
her遺伝子やプロニューラル遺伝子がゼブラフィッシュ神経板における神経分化でどのような機能を持つかについての解析が遅れているが、その一方で、pou2とgbx2の機能に関するTg(hsp70l:gbx2)魚、Tg(hsp70l:en-pou2)魚を利用した解析については当初2年目以降に予定していた計画を今年度前倒しで進め、gbx2とpou2のいずれもがプロニューラル遺伝子やNotchシグナル関連遺伝子の発現を制御することを見出すなど、すでに成果を挙げつつある。
以上のように脳原基領域化と神経分化の統合的制御の解明という目的に照らし、本課題で着実に研究成果が挙がりつつある。従って、研究はおおむね順調に進展しているといえる。
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| Strategy for Future Research Activity |
１）pou2とgbx2の神経板における発現の細胞レベルでの詳細な解析については今後、共焦点レーザー顕微鏡を利用した2色FISHを予定している。
２）Tg(hsp70l:en-pou2) およびTg(hsp70l:gbx2)魚の胚を活用し、pou2およびgbx2の強制発現が各種脳領域化遺伝子と神経分化制御遺伝子に及ぼす作用を検討する。このアプローチにはすでに26年度に着手しており、さらに発展させる。あるいは、pou2およびgbx2にERT2配列を融合させたうえで胚にmRNAとして導入し、tamoxifen誘導を行う。また、これらの誘導性遺伝子にさらにUAS配列を連結した上でゼブラフィッシュゲノムにTol2トランスポゾン法により導入し、得られた導入魚と脳領域特異的なGAL4魚を交配した上、得られた子孫胚でtamoxifen誘導を行う。このように時期特異的、そして領域特異的な強制発現を行った胚において、脳形成と神経分化を検討する。
３）プロニューラルクラスターにおけるher遺伝子やプロニューラル遺伝子の機能を検討するため、これらについてdominant-negative遺伝子を作製し、加温誘導性にしたうえでゲノムに導入する。あるいはERT2配列を融合させたうえで胚にmRNAとして導入し、tamoxifen誘導を行う。
４）現在Tg(hsp70l:en-pou2)胚におけるpou2機能抑制で発現変動する遺伝子をマイクロアレイで検討する準備を進めている。同定されたpou2下流遺伝子候補群について、神経分化における役割、gbx2やpou2 との関わりの検討をおこなう。
５）以上の多面的研究により、ゼブラフィッシュ胚神経板の領域化と神経分化制御機構の統合的理解を目指す。
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| Causes of Carryover |
旅費については200,000円を計上していたが、26年度について、遠隔地での学会に参加せず、比較的近隣（仙台、東京、など）の学会だけとなったため、予定より支出が少なかった（151,760円）。また、実験動物の飼育管理のための謝金を100,000円計上していたが、他の研究費（文部科学省特別経費）をあてることができたため、やはり予定より支出が少なくなった（20,000円）。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
当初の使用計画は、物品費1,000,000円、旅費400,000円、人件費・謝金100,000円、その他100,000円であるが、26年度の差額75,426円は物品費に組み入れる。従って、物品費のみ1,075,426円に変更する。
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