2015 Fiscal Year Research-status Report
細胞内輸送異常を細胞死へと変換するBNip1の機能解析
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26440128
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| Research Institution | Okinawa Institute of Science and Technology Graduate University |
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Principal Investigator |
西脇 優子 沖縄科学技術大学院大学, 神経発生ユニット, 研究員 (20360620)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | BNip1 / 視細胞変性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々は、ゼブラフィッシュのb-SNAP変異体では、細胞死を誘導するBH3ドメインをもつ蛋白質であるBNip1を介して視細胞変性が引き起こされることを報告した。正常な細胞では、BNip1は小胞体に存在し、syntaxin18(stx18) -SNARE複合体の構成因子として、ゴルジ体から小胞体への逆行輸送を制御する。我々は、b-SNAPの機能欠損によって、stx18 -SNARE複合体の分解が阻害されると、その構成因子であるBNip1のBH3ドメインが活性化され、細胞死の経路が活性化するモデルを提唱した。本研究では、小胞体で活性化されたBNip1がどの様にアポトーシスを誘導するのかを明らかにすることで、上記のモデルを検証する。昨年までに、BNip1の細胞死誘導能が小胞体上で活性化され、細胞死抑制因子であるBcl2と相互作用することを明らかにした。その結果、細胞死誘導因子であるBaxがBcl2から離れ、活性化すると考えられる。今年度はヒートショックプロモーターを用いて時期特異的にb-SNAPを発現させることで、BNip1依存性の細胞死を抑制するのにb-SNAPが必要とされる時期が受精後4日目までであることを明らかにした。細胞死が始まる受精後2日目からこの時期までは視細胞外節の成長が著しく膜輸送が盛んに行われているため、この結果はBNip1依存性の細胞死は過剰な輸送に対して感受性があるというモデルを強く示唆する。また、初期にレスキューを行ったb-SNAP変異体で生き残った視細胞はその後緩やかに変性するため、BNip1以外の細胞死も関与している可能性が示唆される。
今年度は引き続き、BNip1はミトコンドリア膜上のBaxを活性化するのか、小胞体でからのCaイオンの放出を介して細胞死を誘導するのか、モルフォリノ等を用いた阻害実験で検証する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今年度は、b-SNAP変異体にヒートショックプロモーターでb-SNAP蛋白を発現するトランスジェニック系統を導入し、時期特異的にレスキューを行うことで、BNip1依存性の細胞死は視細胞外節が盛んに伸びていく時期に高い感受性を示すことを見い出した。モデルの検証は進んでいるので、おおむね順調に進行しているとした。
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| Strategy for Future Research Activity |
(1) BNip1依存性の細胞死を抑制するためにb-SNAPが必要な受精後2-4日と細胞死が抑えられる受精後4日目以降で、外節の伸長速度の差から細胞輸送の量の差を見積もり、実際に過剰な輸送に反応してBNip1依存性の細胞死が起きているのかを検証する。
(2) GCaMPトランスジェニックラインを導入したb-SNAP変異体系統を用いて、Caイオン濃度の可視化を行う。
(3)小胞体は細胞内でCaイオンの貯蔵庫であり、Bcl2ファミリータンパク質は小胞体とミトコンドリアの両方に存在し、双方の間でCaイオンの流動と恒常性を調節している。Baxはこの恒常性を調節することで細胞死を誘導している。小胞体上で活性化されたBNip1がCaイオンの流動性の調節にどう関わるかを調べる。小胞体からのCaイオンの放出を抑えるため、IP3レセプターの阻害を行う。これにより、BNip1が誘導する細胞死がチトクロムCの放出とミトコンドリアのCaイオン取り込みによるアポトーシスの系を介して行われているのか検証する。
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| Causes of Carryover |
今年度は、実験に必要なトランスジェニック系統、TALENによるBNip1の変異体系統をb-SNAPに導入した系統を作製したので、維持管理を手伝うパートタイムの方を昨年より一人増やして雇用した。28年度は、解析が終了した系統に関しては作成にかかる労力が減り、確立した系統に関して維持のみになるため、系統作成維持のために雇用する人員を減らし、その分を阻害実験に必要なモルフォリノ作成や阻害剤などの購入費用と、成果の学会発表のための旅費に回す。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
28年度は、昨年度に引き続き、変異体やトランスジェニック系統の維持のためのパートタイムの雇用を計上する。また、解析のための消耗品、成果の学会発表のための旅費も必要分を計上する。
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