2014 Fiscal Year Research-status Report
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26440141
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
土屋 徹 京都大学, 地球環境学堂, 准教授 (20362569)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | シアノバクテリア / クロロフィルd / 光合成 / 遠赤色光 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
これまでに開発したトランスポゾンタギング用ベクターを利用して、Acaryochloris marinaでのトランスポゾンタギング系を確立した。トランスポゾンの転移頻度はモデルシアノバクテリアであるSynechocystis sp. PCC 6803に対してトランスポゾンタギングを行ったときよりも著しく低かったが、種々の条件検討を行っても改善は見られなかった。得られた100クローン以上の変異体の色素組成をHPLCで解析したが、野生型と比較して有意にクロロフィルd含量が低下した変異体は見いだせなかった。しかし、数は少ないものの定期的に一定数の変異体が得られるようになったことから、今後は変異体の作出とスクリーニングをひたすら進めることで目的の変異体を得ることが可能な段階まで到達したのではないかと考えられた。
A. marina内では複製できない自殺ベクターをもちいてA. marinaでの遺伝子ターゲッティング系の開発を試みた。A. marinaの光化学系2のサブユニットであるCP47遺伝子のC末端にヒスチジンタグが融合するように作製したゲノムと相同なDNA断片に抗生物質耐性遺伝子カセットを挿入したのち、自殺ベクターにクローニングした。接合法により、得られたベクターをA. marinaへ導入し抗生物質で選抜したところ、抗生物質に抵抗性を示すコロニーは得られなかった。さらに、同様のDNA断片を利用して、電気穿孔法によるプラスミドの導入および相同組み換えを試みたが、抗生物質に抵抗性を示すコロニーは得られなかった。本結果はA. marinaでは自殺ベクターをもちいた接合法、電気穿孔法といった常法では遺伝子ターゲッティング系を開発することが困難であることを示唆していると考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、トランスポゾンタギングによりA. marinaの変異体を定期的に作出する系が確立されたという進展がみられた。これは、本研究課題の主たる目的である遠赤色光をもちいて光合成を行うことができるA. marinaでの分子遺伝学的解析が実際に開始したことを意味する。しかし、研究計画で予定していたトランスポゾンの転移頻度の増加については、種々の条件検討を行っても果たせなかった。これは、生物種によって形質転換効率が大きく異なることを反映していると考えられた。
変異体の作出効率の低さから当初予定していた数の変異体をスクリーニングに供してはいないが、変異体の作出と色素組成の解析によるスクリーニングの系が確立されたことにより、A. marinaでの順遺伝学的解析の基盤が整ったといえる。ゆえに、これらの成果は今後の進展を大いに期待させるものであると考えられた。
以上を鑑みて、現在までの達成度は「おおむね順調に進展している」とした。
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| Strategy for Future Research Activity |
主たる目的であるクロロフィルd含量が低下した変異体などのスクリーニングについては、トランスポゾンタギングの効率の上昇が見込めないことから、定期的に少しずつ変異体の作出を進めてゆく。
また、もう一つの目的であるA. marinaでの遺伝子ターゲッティング系については、常法での開発に限界があることが判明したので、戦略を変えて挑戦する。具体的には、近年多くの生物でその有効性が報告されているゲノム編集の技術を適用することを検討している。
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| Causes of Carryover |
本年度は、トランスポゾンタギングで作出したA. marinaの変異体のスクリーニングを大々的に進める予定であったが、トランスポゾンの転移頻度の増加が果たせず計画どおりに十分な数の変異体を作出できなかった。そのため、限られた数の変異体のスクリーニングしか行えなかったため、当初の計画から進展が少し遅れてしまった。ゆえに、未使用額が生じることになった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度の研究費は、物品費を主として使用する予定である。本研究を推進する上で新たな購入が必要とされる高額機器はないので、研究費は分子生物学実験等に使用する消耗品や研究成果を発表するための旅費などに充てる予定である。
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