2014 Fiscal Year Research-status Report
シロイヌナズナCLV3下流におけるSUMO化タンパク質の網羅的解析
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26440151
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
山口 泰華 熊本大学, 自然科学研究科, 学術振興会 特別研究員 (RPD) (90448522)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | CLE遺伝子 / シロイヌナズナ / CLV3 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題では、シロイヌナズナを実験生物としてその器官形成における分裂組織の活性調節機構を明らかにするために、特にCLV3ペプチドホルモンのSUMO化に関する作用様式に着目して解析を進めることを計画した。しかし、シロイヌナズナでは、CLV3以外に、CLV3様のCLEシグナル領域をもつ31種類ものCLE遺伝子群が同定されている。これまでの研究結果から、植物体の茎頂・根端分裂組織など様々な領域で複数のCLE遺伝子が発現していることがレポーター解析によって確認され、またCLE遺伝子の強制発現体 (Gain-of-function)解析などから、CLV3遺伝子を含め、CLE遺伝子群が非常に複雑に相互作用して、様々な組織の形成を調節することが理解されている。ところが、植物での遺伝子発現様式の解析がレポーター解析にとどまっていることや植物での遺伝子機能欠損技術(Loss-of-function)がなかったことから、どのCLE遺伝子がどこで発現しており、どの組織形成に必須であるかなど、分子生物学的、遺伝学的解析がほとんど進んでいないという問題があった。
そこで、本課題ではCLV3遺伝子だけではなく、これらCLE遺伝子群の植物器官形成における分子機構を解明するべく、①CRISPRを用いたCLE遺伝子群の網羅的な遺伝子欠損体の作成と表現型の解析、および②根端部におけるCLE遺伝子群のmRNAの発現様式の解析(Whole-mount-In Situ Hybridization)を計画し、昨年度はその遂行に努めた。さらに、数多くの研究者に利用してもらうことを想定して、CLE遺伝子のあらゆる欠損体を網羅したリソースにするため、他のリソースセンターからもCLE遺伝子改変種を取り寄せ、より充実したリソースの樹立を目指している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究室ではCRISPR法ををもちいて、まずCLV3遺伝子を標的とした遺伝子欠損体の作成を行ない、CLV3遺伝子欠損体の作成に成功した。現在では、この方法をもちいて、シロイヌナズナの遺伝子欠損体を非常に効率よく作成できる段階になっており、すでに半数のCLE遺伝子群の遺伝子欠損体の選抜作業に取りかかっている。また、CLE遺伝子群の根端部における発現様式については、RT-PCR法で先行実験を行なったところ、これまでレポーター解析により根端部で発現していると予想された幾つかのCLE遺伝子については、発現が検出されないことが明らかになった。さらに、シロイヌナズナ根端部における、CLE遺伝子の組織学的な発現様式を明らかにするために、WISH法を用いているが、この手法については実験の効率化を図るため、本研究室の所有しているinsituPro VSi (Intavis)を利用して行なっている。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度は、研究をさらに進め、これまで得られなかったすべてのCLE遺伝子のシロイヌナズナ変異体の作成を完了する。次いで、他のリソースセンターより取り寄せた変異体も合わせて、特に根端部や茎頂部といった、植物体全体の構造を決定する重要な組織について、表現型の解析を行なう予定である。これまでの断片的な報告からは、単一の変異体では表現型が明瞭でなく、複数のCLE遺伝子が相補的に機能することが予想されるので、よく似たペプチド配列をもつCLE遺伝子変異体同士をかけ合わせて二重変異、三重変異体を作成し、それらの表現型について明らかにしていく予定である。また、CLE遺伝子の発現様式についてもWISH法を用いて明らかにし、上記の表現型と照らし合わせてそれぞれの遺伝子の機能について明確にしていく予定である。
これらのデータとともに、すべてのCLE遺伝子欠損体のリソース作成後は、その結果を当初の計画通りホームページを作成して閲覧可能にし、多くの研究者に利用しやすい環境を整えて行く予定である。
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| Causes of Carryover |
本年度は、遺伝子欠損体の作成と遺伝子発現の解析を行なうため、当初はこれらの実験に必要な器材と試薬の購入を予定して使用額を算出した。しかし、実際に実験を行なってみると、すでにある程度の器材と試薬は揃っており、最低限必要な物品を購入するだけで実験を進めることができた。また、研究活動の効率化を図るため、人件費への転用も考慮にいれたが、本研究室には数多くの技術習得済みの学生がおり、彼らの補助があったため、新しく技術補佐員などを雇い入れる必要もなかった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度は、引き続き遺伝子欠損体の作成と遺伝子発現の解析を行ないつつ、さらに作成した大量の遺伝子欠損体の管理およびその表現型の解析を行なう必要がある。実験が新しい段階に入るため、それぞれの実験に必要な器材や試薬などを購入するための物品費はもちろんのこと、手数が足りなくなる恐れがあるため、申請時には予定していなかったが、今後の状況を判断しつつ技術補佐員の雇用も検討していきたいと考えており、次年度使用額を予定した。
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Research Products
(2 results)
