2014 Fiscal Year Research-status Report
グレリン－モチリン系による消化管運動調節機構に関する比較生物学的研究
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26440169
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| Research Institution | Rakuno Gakuen University |
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Principal Investigator |
北澤 多喜雄 酪農学園大学, 獣医学群, 教授 (50146338)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
海谷 啓之 独立行政法人国立循環器病研究センター, その他部局等, その他 (40300975)
寺岡 宏樹 酪農学園大学, 獣医学群, 教授 (50222146)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | グレリン / モチリン / 消化管運動 / 鳥類 / 両生類 / 魚類 / 受容体 / 系統発生 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
2014年度の実績は以下に示す通りである。
①ニワトリ：2013年度までの科学研究費（23570081）で行っていたニワトリ成長過程(1-100日齢)での中枢神経、消化管各部位におけるグレリン、グレリン受容体(GHS-R1a)およびグレリン脂肪酸添加酵素（GOAT）mRNAの発現について検討しその相互関係を解析して論文を作成した。論文は、Peptides63、134-142,2015に掲載された。
②両生類：ウシガエルとアカハライモリ消化管においてグレリンとモチリンの作用を検討した。グレリンは2種類の両生類の消化管運動に著明な影響を与えなかった。受容体mRNAはイモリではカエルに比べて発現量が極めて少なかった。また、ウシガエルでは下部消化管で粘膜に多く受容体の発現が見られ、グレリンが消化管運動調節以外に関与する可能性を示唆した。モチリンはウシガエルの上部消化管標本に対してのみ収縮を誘起した。カエルとイモリの消化管に対するグレリン、モチリンの作用に関しては論文を投稿準備中である（Comp. Gen. Endocrinolに投稿予定、2015年度前半）。
③ゼブラフィッシュ：ゼブラフィッシュにおけるグレリン、モチリンの作用を検討するためモチリン受容体に注目しゼブラフィッシュでのクローニングを開始した。クローニング出来れば組織分布を検討する。GHS-R1aに関して既報論文にある構造で発現が確認できた。今後、GHS-R1a、モチリン受容体のノックダウンを行いその成長への影響を明らかにしていく予定である。
④モルモット：共同研究者の海谷が同定したモルモットグレリンが、他の哺乳動物とかなり構造が異なっていたために、発現細胞での作用と摘出消化管での作用を検討した。アミノ酸構造の差はあまり機能には反映されず、発現細胞ではラットグレリンと同じ活性を示した。一方、消化管では著明な作用を起さなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初の予定より遅れている原因としては、以下の二つが考えられる。
1つ目は、2011-2013年度までの科学研究費で行っていた「ニワトリ消化管と中枢神経のグレリン関連分子mRNAの成長過程での変化」についての論文作成、投稿そしてコメントに関するレスポンスにおもいのほか時間を要してしまったことである（論文は最終的にはPeptidesに掲載された）。
二つ目としては、モルモットのグレリン構造を検討している過程で1-10位までのアミノ酸構造（これまで殆どの哺乳動物で共通）が、この動物種では著しく異なることが明らかになった。そのため、このペプチドを合成してその作用をモルモットで検討する研究も同時進行している状態であった。また、モルモットでは存在するか否か議論が多いモルモットモチリンに関する研究も行っていたため、そちらの検討にも時間がとられた。モチリンに関しては消化管を用いた検討ではnegativeな反応しか得られなかった。また、遺伝子dataベースの解析ではモルモットではモチリン、モチリン受容体とも偽遺伝子化し機能していない可能性が高いことがわかった。モルモットでのグレリン作用の解明はまだ継続中であるが、2015年度はそれほどの時間をとられることはないと考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度は、両生類(ウシカエル）と魚類(ゼブラフィッシュ）に的を絞り以下の研究を進めていく予定です。
先ず両生類(ウシカエル）では、現在作成中の論文を投稿する。この論文ではグレリンでは作用が認められないもののモチリンについては上部小腸で収縮が起きる可能性を示している。ウシガエルに関しては、モチリン受容体遺伝子が存在する可能性が遺伝子解析から指摘されるため、この遺伝子をクローニングして、測定系と発現系を作成して組織分布とモチリンによる反応を明らかにしていく。ついで、ウシガエルの消化管をhomogenateしてHPLCで分画したものを発現細胞系に適用して活性物質が含まれるか、含まれるとすればその構造を明らかにしていく。明らかになった物質を合成してカエル消化管でその活性を確認する。
ゼブラフィッシュにおいては、先ずは消化管収縮の測定系を確立して既知のグレリン、モチリンを適用してその作用を観察する。現在取り掛かりつつあるゼブラフィッシュモチリン受容体がクローニングできれば組織分布や発生過程での変化を明らかにすることができる。ゼブラフィッシュではGHS-R1aは同定されており、組織分布も知られているが、今回の解析ではこの結果についてついて再度検証する。モチリン受容体、GHS-R1aに関してアンチセンスモルフォリノを用いた標的遺伝子ノックダウン実験を行い、ゼブラフィッシュの組織構築や成長におよぼす両ペプチドの役割について検討する。
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| Causes of Carryover |
2013年度までの科学研究費の課題（ニワトリ成長過程でのグレリンの作用等に関する研究）のまとめと論文作成、あと投稿した論文のrevised等に時間が割かれたのと、モルモットにおける研究で時間がとられたために本来の両生類（ウシガエル、イモリ）や魚類(ゼブラフィッシュ）を用いた検討を強力に押し進めていくことが時間的に難しくなり、研究自体に少し遅れが生じ次年度使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
ゼブラフィッシュでのグレリン、モチリン系の検討では、既知のゼブラフィッシュグレリン、モチリン様peptideの合成が必要であり、これら合成には50万円程度が必要になる。また、ゼブラフィッシュで遺伝子ノックダウンのために用いるモルフォリノも濃度、注入のタイミング等を検討しなければならず、予備検討が必要である。また、ノックダウンもモチリン様物質、モチリン受容体、グレリン、グレリン受容体(3種）を考えるとノックダウンするだけでも40万円程度が必要になる。また、ゼブラフィッシュの消化管での収縮は微小と考えれるので、これを測定するための装置に20万円程度支出することになる。
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