2014 Fiscal Year Research-status Report
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26440171
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| Research Institution | Waseda University |
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Principal Investigator |
加藤 尚志 早稲田大学, 教育・総合科学学術院, 教授 (80350388)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | エリスロポエチン / トロンボポエチン / アフリカツメガエル / ネッタイツメガエル / 造血 / 赤血球 / 栓球 / 環境 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は，脊椎動物における調節系の多様性と普遍性を理解する一端として，両生類アフリカツメガエル及びネッタイツメガエルの末梢赤血球数及び末梢栓球数の調節の仕組み，特に低酸素あるいは低温による環境ストレスに応答して変動する血球産生の調節に焦点を当てて取り組む。第1年度では，低酸素in vivoモデルの作出，低酸素化マーカーの探索，低温暴露モデルとの比較，組換えEPO／TPO免疫開始を予定し展開した。
アフリカツメガエル成体を低酸素環境に曝露するために，窒素曝気によって飼育水の溶存酸素濃度を2.2 mg/Lに下げ、ツメガエルを虫かごに補足し30分浸水後，自由に5分間肺呼吸させた。これを6サイクル繰り返す反復潜水モデルを確立した。潜水個体の肺と肝臓の95%以上の細胞は低酸素マーカーのピモニダゾール陽性で低酸素化を認め，肺水腫様の肺障害も認めた。またマロンジアルデヒドを測定する脂質過酸化測定法による酸化ストレスを検出した。従って肺で高発現するEPOの組織障害修復活性を調べる有用なモデルが確立した。
低温暴露モデルにおいては，特に低温曝露後の末梢栓球数減少に注目し，抗栓球抗体（T12）陽性の末梢栓球数数変化をフローサイトメトリーで計測し，また体外で蛍光標識した栓球の再輸血後の臓器分布を追跡した。その結果，低温曝露2時間後から6時間後に末梢栓球数は最低値に達し，その後も低低値を維持した。栓球の一部は脾臓に移行した。このように低温曝露モデルでも，造血制御と連鎖する環境応答を確認することができた。
尚，組換えアフリカツメガエルEPOおよびTPOのモノクローナル抗体作出のため，完全なEPOとTPOの活性体をより高効率的に調製し，安定した長期保存の方法の確立を目指すことにした。今年度はxlEPO，xlTPOのそれぞれについてマルトース結合蛋白質融合組換え体の大腸菌発現系の構築を着手した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
第1年度の実施予定項目は，低酸素曝露in vivoツメガエルモデル，低温曝露in vivoツメガエルモデルを作出し，赤血球数増減や造血因子発現を調べることや，マウスに組換えEPO／TPOの免疫を開始し，モノクローナル抗体の作出に着手することである。これらのうち，最も高度な実施課題であった低酸素曝露in vivoモデル，低温曝露in vivoモデルの両方とも基礎展開を終了し，学会においても成果発表することができた。従って第2年度移行の分子解析へ進めるための目処がついたといえる。一方，EPO，TPOのモノクローナル抗体作出の着手については，免疫抗原となる遺伝子組換え体の調製方法について，再検討することにした。このため，免疫開始は遅れるが，もとより造血因子の質の確保は長期的視野で重要な課題であり不可避である。それを補完するために，EPOについてはポリクローナル抗体の特性の見直しを再度進めた。その結果，EPO定量系については培養上清等の試料であれば定量測定可能なELISAを試験的に開発した（血液試料については尚も検討を要する）。また，電気泳動後のウエスタンブロット法によるEPOやTPO分子の酵素免疫的検出に際しては，ポリクローナル抗体を利用する。一方，EPO受容体を認識するモノクローナル抗体の作出と抗体性状の確認はほぼ順調である。
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| Strategy for Future Research Activity |
第2年度では，組換えEPOとTPOのマウス免疫あるいは並行して，EPOやTPOの高純度高活性組換え体が得られれば，ポリクローナル抗体の作出を開始する。ハイブリドーマを半固形培地中で高速選別して単クローン化し（実施経験有り），高性能の抗体を選別する。EPOやTPOの定量系は，各々モノクローナル抗体を2種使う常法によってELISAを構築する。目標測定感度は，数pg/mlである。大腸菌発現組換え体の分子吸光係数（計算値）で校正した標品を標準試料とする。
「リガンド受容体結合調節モデル」を証明する鍵データとなるリガンド-受容体の活性定量解析は，フローサイトメトリ法で分離した受容体発現血球前駆細胞や受容体を発現する末梢血球と，組換えEPO／TPOとを生理的条件下で混合する。その上清に残るEPO／TPOをELISAまたはバイオアッセイで測定し，これらの細胞にEPOやTPOが吸着することを検証する。
オミクス解析に関しては，第1年度で確立した低酸素曝露モデル，低温曝露モデルに関して，肝臓，脾臓，腎臓，骨髄などを取出し，プロテオミクス解析へ進める。同定蛋白質リストをin silicoパスウエイ解析（Pathway Studio）に進め，環境刺激と連動するパスウエイを抽出し，血球調節に至る分子機序の探索を試みる。
第3年度では，特にオミクスから得た知見と，実計測から獲得したデータの整合性を追求し，本研究の総括へ向かう。
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