2015 Fiscal Year Research-status Report
アンフィビアスに至る脊椎動物の進化モデル動物のグレリンシステムの変遷
| Project/Area Number |
26440174
|
|---|
| Research Institution | National Cardiovascular Center Research Institute |
|---|
Principal Investigator |
海谷 啓之 国立研究開発法人国立循環器病研究センター, 研究所, 室長 (40300975)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
宮里 幹也 国立研究開発法人国立循環器病研究センター, 研究所, 部長 (50291183)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
|
| Keywords | グレリン / グレリン受容体 / アホロートル / イベリアトゲイモリ / チョウザメ / 遺伝子発現 / 発生 / 定量的PCR |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
グレリンは、成長ホルモン分泌や摂食、エネルギー代謝などを調節するホルモンである。本研究は、水棲動物が陸に進出する過程のモデルとなる動物に注目し、グレリンやその受容体の存在意義について考察する。平成２７年度は、（１）アホロートル（メキシコサラマンダー）のグレリン受容体の発現調節、（２）イベリアトゲイモリのグレリンの探索、（３）チョウザメにおけるグレリン遺伝子発現調節、について進展があった。
（１）獲得している２種類の受容体のフラグメントを仮にGHS-R1、GHS-R2と呼ぶ。それぞれに特異的なプライマーを作製し、3’および 5’-RACE PCRにて全長cDNAの獲得を試みた。3’側の塩基配列は決定できたが、5’ 側は完全長が得られていない。3’-RACE PCRで得た塩基配列をもとに、定量的PCRを確立し、GHS-R1、GHS-R2の組織分布を調べた。その結果、GHS-R1 mRNAは脳に最も多く、次いで脂肪、腎臓、精巣、胃腸管で高い発現が見られた。GHS-R2の遺伝子発現量GHS-R1の1/10程度で、脳と下垂体に限局していた。
（２）鳥取大から供与していただいたイベリアトゲイモリの２個体分の胃抽出物からグレリンの単離することを試みたが、構造決定には至らなかった。胃のtotal RNAからPCRでのクローニングを試みた。既知の両生類グレリンの塩基配列を元にして作製したプライマーを用いてPCRを行ったが、期待されたPCR産物は得ることができなかった。
（３）チョウザメ（ベステル：Huso huso×Acipenser ruthenus交雑種）の発生過程におけるグレリン遺伝子発現を定量的PCRにて調べた。受精卵では弱いながら遺伝子発現が認められ、受精後６日までに８～240コピー/100ng total RNAまで遺伝子発現が上昇し、孵化後１０日には670～950コピー/100ng total RNA、２０日には4300コピー/100ng total RNAまで急激に遺伝子発現が上昇した。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
全体計画の中で、平成２７年度までの達成度は約５０％である。それぞれについては以下の通り。
（１）下垂体でグレリンが作用する機序の解明（達成度５０％）：昨年度、ツメガエルにおいてグレリン受容体に似た２種類の受容体をクローニング後、機能を解析し、それらのオーソログをウシガエルやアマガエルから同定する予定であったが、ツメガエルでその２種の受容体の全長cDNAを得る過程の5’RACE –PCRで期待される産物が未だに得られていない。（２）イモリにおける摂食調節（達成度２０％）：合成イモリグレリンを投与して実験を行ったが、実験中、餌を食べなくなる問題が起こった。個体隔離の影響がありそうだが、検討中に冬場になり摂餌量が落ちた。（３）アホロートルGHS-R1a cDNAのクローニング（達成度５０％）：アホロートルでは２種類の断片が同定できている。RACE-PCRで増幅を試みているが全長は得られていない。（４）肺魚GHS-R1a cDNAのクローニング（達成度１００％）：終了し、論文として公表済み（Gen Comp Endocrinol., 209: 106-117 (2014)）。（５）チョウザメグレリンの単離とcDNAクローニング（達成度９０％）：ベステルの胃からグレリンと、そのcDNAのクローニングに成功している。今年度、組織分布や初期発生過程におけるグレリンmRNAの発現を調べた。（６）アホロートルと肺魚のグレリンの単離とcDNAクローニング（達成度２０％）：胃の組織は収集中である。cDNAクローニングは、胃のcDNAを用いて既知のグレリンの塩基配列からさまざまなプライマーをデザインしてPCRを行ったが、期待される産物が得られていない。（７）チョウザメグレリン受容体のcDNAクローニングと機能解析（達成度１０％）：保有している胃のcDNAを用いてPCRを行ったが目的物の増幅が見られていない。遺伝子発現量が少ない可能性がある。
|
| Strategy for Future Research Activity |
（１）下垂体でグレリンが作用する機序の解明：ツメガエルにあるグレリン受容体に類似した２種類の受容体をツメガエルでクローニングしなければならない。下垂体サンプルを含め、サンプルを新たに調整し、受容体の組織分布を調べ、遺伝子発現量の多い組織を選定するとともに、テンプレートcDNAの再調整、RACE-PCRの条件設定の見直しを行う。得られた情報から、それらのオーソログをウシガエルやアマガエルから同定する。（２）イモリにおけるグレリンの摂食調節：摂餌量を測定できる実験条件を設定する。個体隔離の影響を考慮し、数匹をグループとしてイモリグレリン投与実験を行う。（３）アホロートルGHS-R1a cDNAのクローニング：定量的PCRで組織分布と遺伝子発現量を特定した。cDNA単離に有効な組織を用いて全長cDNAの単離を目指す。（４）肺魚GHS-R1a cDNAのクローニング：完了（５）チョウザメグレリンの単離とcDNAクローニング：グレリン遺伝子を単離して塩基配列と遺伝子構造を決める。（６）アホロートルと肺魚のグレリンの単離とcDNAクローニング：胃（腸）のcDNAを用いて、再度cDNAクローニングを試みる。胃からペプチドを単離するため、１０gの胃（１匹約0.5g）を目標に収集している。（７）チョウザメグレリンとGHS-R1a cDNAクローニングと機能解析：脳や下垂体のサンプルを入手し着手する。
|
| Causes of Carryover |
27年度は計画していた動物の購入を行わなかった分、研究費が残ることとなった。
|
| Expenditure Plan for Carryover Budget |
最終年度となる28年度に計画している動物購入および組織採集を遂行するので、この研究費はその実行に充てる。
|
