2015 Fiscal Year Research-status Report
各種アブラムシにおける細菌由来水平転移遺伝子群の網羅的探索と進化解析
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26440196
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| Research Institution | Toyohashi University of Technology |
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Principal Investigator |
岡村 恵子 豊橋技術科学大学, エレクトロニクス先端融合研究所, 研究員 (10570533)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | アブラムシ / 菌細胞 / 相利共生 / 遺伝子水平転移 / オーソログ遺伝子 / 分子系統解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
アブラムシは、腹部体腔内の「菌細胞」に収納した共生細菌「ブフネラ」と強固な相利共生関係を築いている。先ごろ、「エンドウヒゲナガアブラムシ」のゲノム上に、共生細菌ブフネラ以外の細菌から水平転移し、菌細胞内で特異的に発現が亢進している遺伝子群が発見され、ブフネラとの共生において重要な役割を果たしていることが示唆された。本研究では、90種アブラムシを用いて水平転移遺伝子の検出と構造解析・分子系統解析を行い、これらがアブラムシの進化の歴史上、「いつ獲得され、その後どのように進化・多様化してきたのか。」という疑問の解明を試みた。
「エンドウヒゲナガアブラムシ」のゲノムより見つかった細菌由来水平転移遺伝子LdcA1遺伝子のオーソログを、データベースより抽出して多重アラインメントを行い、保存性の高い領域をもとに縮重プライマーを設計した。そして90種アブラムシのDNAを鋳型として縮重PCRを行い、アガロースゲル電気泳動にて目的領域の増幅を確認した。また、これらのPCR産物を標的とし、エンドウヒゲナガアブラムシLdcA1遺伝子の部分配列（約470塩基）をプローブDNAとしたサザンブロッティング解析を行った。その結果、全てのアブラムシのPCR産物からシグナルが検出でき、90種アブラムシには、エンドウヒガナガアブラムシと同様のLdcA1遺伝子が存在することが示された。さらに陽性シグナルが得られたサイズ領域のDNA断片について、TAクローニング法によるサブクローニングを行った。これにより得られた大腸菌コロニーをナイロンメンブレンに転写し、エンドウヒゲナガアブラムシのLdcA1遺伝子部分配列（約470塩基）をプローブとしたコロニーハイブリダイゼーションを行った。陽性シグナルが得られた大腸菌のコロニーについて、コロニーPCRによりプラスミドベクター内の挿入DNA断片を増幅し、シークエンス解析を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
現在までの研究成果は、申請時の研究目的および当該年度の研究実施計画にほぼ準じているため。
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| Strategy for Future Research Activity |
基本的には、申請時の研究計画に準ずる。
1.水平転移遺伝子のコピー数・構造の解析:シークエンス解析から得られた、同一アブラムシ由来の配列多様性にもとづき水平転移後の遺伝子増幅の可能性を検証するとともに、各遺伝子の構造を精査し、ORF構造やKa/Ks解析により、各配列のタンパク質コード遺伝子としての機能性を検討する。
2.分子系統解析：以上より得た各種アブラムシのLdcA1、AmiD、bLys、RlpA遺伝子のオーソログ配列について、マルチプルアラインメント（MAFFTを使用）を行う。分子系統解析は近隣結合法（PHYLIP 3.6, Neighbor）および最尤法（RAxML）により行う。
3.各種アブラムシの系統的位置付けの確認：上記90種のアブラムシについて、真核生物の系統評価の際に一般的に用いられているミトコンドリアゲノムのCOI（シトクロームオキシダーゼサブユニットI）遺伝子やEF-αI（翻訳伸長因子-αIサブユニット）などを標的にPCRを行い、増幅産物を精製したのち、塩基配列を決定する。2.と同様に分子系統解析を行う。
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| Causes of Carryover |
昨年度と同様に、研究を遂行するにつれて、実験技術が向上し、失敗を最小限にとどめることができるようになった。そのため、予定していた分子生物関連の試薬の使用量を抑えることができたため。また、試薬の一部を自作することで、大幅な節約が可能となった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度には新たな解析方法を採用するので、ハード面での充実を図るため、次年度使用額と翌年度分を併用する必要がある。
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