2016 Fiscal Year Research-status Report
サツマイモ野生2倍体種の自家不和合性における自他認識因子の決定
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26450002
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| Research Institution | Mie University |
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Principal Investigator |
土屋 亨 三重大学, 地域イノベーション推進機構, 准教授 (30293806)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 自家不和合性 / サツマイモ野生種 / 自他認識機構 / S遺伝子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
高等植物の自家不和合性においては雌雄の生殖器官が正常に発達するものの、自殖または同一自家不和合性表現型（S表現型）の個体間での交配では種子が得られない。サツマイモ野生2倍体種は胞子体型自家不和合性を示し、雄側のS候補遺伝子としてAB2、雌側のS候補遺伝子としてSE2とSEAがそれぞれ同定されているが、S遺伝子を決定する直接的証拠を得るには至っていない。
そこで各S候補遺伝子を導入した形質転換体の作出を行い、導入遺伝子の効果の検証を試みるべく実験を行ったが、サツマイモ野生2倍体種の形質転換効率は非常に低いものであった。そこで培養条件の検討を進めると共に、カルス誘導の際の初発器官（成長点、葉柄、葉身等）間の差異、サツマイモ野生2倍体種の系統間差異について検討し、最適な培養条件、初発材料、系統を見出した。
導入遺伝子については、各S候補遺伝子の2kbp前後のプロモーター並びにターミネーターを含む領域をPCRで増幅しバイナリーベクター上に導入したセンスコンストラクト、各S候補遺伝子のノックアウトを行うためのガイドRNAとCRISPR/Cas9の遺伝子をバイナリーベクター上に導入したゲノム編集コンストラクトを作成た。これまでに、これらを導入した形質転換個体が得られたため、今後これらの開花促進を行い、交配によって導入遺伝子の効果を確認する。
また、一方で、これまで明らかにしたS1及びS10-S遺伝子座の配列に加え、新たにS3及びSc（自家和合性系統）のS遺伝子座の配列を決定した。これら配列の比較検討を行ったところ、S候補遺伝子のうち雄側のAB2と雌側のSEAは全ての自家不和合性系統（S1, S10, S3）で維持されており、全てのS候補遺伝子が自家和合性系統で機能していなかったことから、AB2とSEAがS遺伝子の最有力候補となった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初予定では平成28年度内にS遺伝子の決定を行う予定であったが、形質転換体の獲得に予想以上に時間がかかり、研究期間の延長を行った。
サツマイモ野生2倍体種の形質転換については研究報告例が極めて少なく、培養条件、カルス誘導の際の初発器官（成長点、葉柄、葉身等）間の差異、サツマイモ野生2倍体種の系統間差異について検討せざるを得なかったが、約1年間の検討により、最適な培養条件、初発器官、系統を見出すことができた。現在、確立した条件に基づき、S候補遺伝子のセンスコンストラクト並びにゲノム編集コンストラクトを導入した形質転換体が得られつつある状況で、今後、得られた再分化個体の開花促進を行い、形質転換体間ならびに非形質転換体との交配を行うことで導入した遺伝子の効果を検討し、S遺伝子の決定を行う予定である。
形質転換体獲得に時間が要することが年度当初に予想されたため、複数系統のS遺伝子座配列を比較することで研究目的を達成できないかと考え、新たにS3系統とSc（自家和合性）系統のS遺伝子座配列を決定し、既知のS1, S10-S遺伝子座と比較検討した。その結果、S候補遺伝子のうち雄側のAB2と雌側のSEAは全ての自家不和合性系統（S1, S10, S3）で維持されており、全てのS候補遺伝子がSc（自家和合性）系統で機能していなかったことから、AB2とSEAがS遺伝子の最有力候補と決定するに至った。
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| Strategy for Future Research Activity |
センスコンストラクトを導入したサツマイモ野生2倍体種については複数系統の再分化個体が得られており、馴化した後に導入遺伝子の保持の再確認を行った後に、開花促進を行って交配実験（形質転換体間、ならびに複数系統の非形質転換体の交配）を行い、導入したS候補遺伝子の効果について検証する。ゲノム編集コンストラクトを導入したサツマイモ野生2倍体種は今後得られると予想され、これらについてはS候補遺伝子のノックアウト効果の検証をゲノムレベル、mRNAレベルで行った後に交配実験に供する予定である。
また、これまでに獲得した複数の自家不和合性系統のS遺伝子座の配列と自家和合性系統のS遺伝子座の配列に加え、新たなS遺伝子座の解析を行い、S遺伝子の決定に向けた情報を蓄積すると共に、S遺伝子座の進化の過程を解析し、新たな研究展開を図るための一助とする予定である。
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| Causes of Carryover |
本研究は当初計画では平成28年度までの研究期間となっていたが、サツマイモ野生2倍体種への遺伝子導入条件の確立に予想以上に時間を要したため、1年間の補助事業期間延長申請を行い受理頂いた（備考欄参照）。最終年度となる平成29年度内にサツマイモ野生2倍体種のS遺伝子の決定を行うため、現在、形質転換体の再分化ならびに再分化個体の育成を進めている状況である。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度使用額の多くは、形質転換体獲得のための培養用試薬・器具類、再分化個体の育成のための土壌・栽培容器の購入、並びに、形質転換体解析のための分子生物学試薬・器具類の購入に充当する。
また、本年9月、並びに、12月に開催が予定されている学会・研究集会において、本研究の成果を発表する機会が研究代表者に与えられているため、出張旅費の一部を本予算から拠出する予定である。
さらに、本研究の成果を学術雑誌に発表するための費用の一部を本予算から拠出する計画である。
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