バラ科果樹におけるソースシンク能の糖シグナルとホルモンによる協同的制御機構の解明

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26450033
• Research Institution: Kobe University
• Principal Investigator: 鈴木 康生 神戸大学, (連合)農学研究科(研究院), 助教 (30335426)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: ソルビトール / 糖シグナル / バラ科果樹

Outline of Annual Research Achievements

バラ科果樹のソースとシンクのキー酵素の、糖シグナル及び植物ホルモンのクロストークによる遺伝子発現プロファイルの解明においては、研究材料からのRNA抽出が時間と労力を要し、研究の推進を大きく制限するものであった。そこで、多検体のハイスループットな抽出方法を検討した。その結果、高分子化合物を用いる等により、従来法と比べ極めて短時間かつ同時に多検体から調製しうるRNA抽出法を確立した。また、ソース能及びシンク能のキー酵素であるソルビトール６リン酸脱水素酵素（S6PDH）及びソルビトール脱水素酵素（SDH）の発現を活性レベル及び遺伝子レベルだけでなく、タンパク質レベルでの発現をも明らかにするため、それらの抗体を調製した。糖シグナルとしてのソルビトールによる転写制御機構の解明するために、ソルビトールに発現を制御される遺伝子のシスエレメントの決定をアラビドプシスで試みた。アラビドプシスには、SDHホモログが単一遺伝子として存在することが明らかとなっている。アラビドプシスの本葉を用いて、ソルビトール処理によりSDH遺伝子の発現が誘導される実験系を確立した。すなわち、SDH遺伝子はソルビトール及びマニトールで発現が特異的に誘導され、スクロースやヘキソースなどの糖で発現が抑制された。また、発現誘導の処理時間及び濃度の影響が明らかとなった。さらに、SDH遺伝子のプロモーター解析を行うために、SDH遺伝子のゲノム上流およそ5kbの単離を行うとともに、遺伝子発現解析を行うためのトランジェントアッセイ系を導入するために、アラビドプシスの培養細胞を用いた解析も行った。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

バラ科果樹のソースとシンクのキー酵素の、糖シグナル及び植物ホルモンのクロストークによる遺伝子発現プロファイルの解明において、従来法に比べ、極めて短時間かつ多検体からのハイスループットな調整法を確立したことにより、今後極めて迅速に研究を遂行することが期待できる。また、糖シグナルとしてのソルビトールによる転写制御機構の解明するための第一段階であるソルビトールに発現を制御される遺伝子のシスエレメントを決定するうえでの実験系をアラビドプシスで確立することができた。この発見により、当該研究を進める上での重要な基盤を築くことができた。これらに加え、プロモーター領域の単離やトランジェントアッセイ系の導入など実験も進んでいる。

Strategy for Future Research Activity

H２６年度に確立したRNA抽出法を用いて、糖と植物ホルモンを処理した際の、ソースとシンクのキー酵素及び糖のシグナルトランスダクションのキー酵素の遺伝子発現の変動を明らかにし、バラ科果樹の糖シグナル及び植物ホルモンのクロストークによる遺伝子発現プロファイルを明らかにする。合わせて、S6PDHとSDHについてはタンパク質レベルでの発現も調べる。糖シグナルとしてのソルビトールによる転写制御機構の解明するために、アラビドプシスのSDHのプロモーター領域を単離したのち、SDHプロモーター：GUSコンストラクトを作成し、アラビドプシスあるいは培養細胞系に導入し、ソルビトール及び植物ホルモンによる発現制御を調べるとともに、アラビドプシスにおいてソルビトールによって発現が制御されると予想される遺伝子群の発現を調べ、プロモーター領域に関する情報を収集し、シスエレメントを決定する。

Causes of Carryover

研究を進めていく上で必要に応じて研究費を執行していたが、申請者が所属機関を移動することとなり年度末に予定していた研究のための時間が若干確保できなくなり、そのため当初の見込み額と執行額が若干異なった。

Expenditure Plan for Carryover Budget

当初の見込み額と執行額の差は若干であり、研究計画に変更はなく、前年度の研究費も含め、当初予定通りの計画を進めていく