2014 Fiscal Year Research-status Report
花弁特異的シスエレメントの同定と「青いチューリップ」創出への応用
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26450049
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| Research Institution | Toyama Prefectural Agricultural, Forestry & Fisheries Research Center Forestry Research Institute / Toyama Prefectural Agricultural, Forestry & Fisheries Research Center Forest Products Research Institute |
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Principal Investigator |
荘司 和明 富山県農林水産総合技術センター(農業研究所、森林研究所及び木材研究所), 農業バイオセンター, 副主幹研究員 (50504461)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山本 将之 富山大学, その他の研究科, 講師 (10456402)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | シスエレメント / プロモーター / 形質転換体 / チューリップ / ユリ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
(1)シスエレメント配列の解析： これまでの解析によりチューリップMYBプロモーター領域(1.2 kb)およびユリMYBプロモーター領域(2.8kb)の中でシスエレメントが存在すると推定された領域は各々200 bpと150 bpである。この結果を基にiPCR法により各シスエレメント領域の任意の部位に40 bp～20 bpの欠失変異を導入し、花弁細胞における青色化の有無による更なるシスエレメント領域の絞り込みを行った結果、チューリップでは異なる2ヶ所の20 bp欠失部位に、ユリでは隣接する2ヶ所の20 bp欠失部位にそれぞれシスエレメント配列が存在することが示された。
(2)プロモーター領域の定量化： ユリMYBプロモーターの活性を定量化するために(1)で明らかになったシスエレメント配列領域をルシフェラーゼ(Luc)遺伝子に繋いだベクターを構築し、花弁細胞に遺伝子導入を行いLuc活性を測定した。その結果、シスエレメント領域を1個、2個、3個とタンデムに繋ぐに従い活性の上昇が認められたことから、この領域が花弁での遺伝子発現を強く促す能力を有することが示唆された。チューリップMYBプロモーター活性の定量化についても現在解析を進めている。
(3)形質転換体の作出： チューリップの組織培養系を活用した形質転換法について、遺伝子導入効率の向上と形質転換体作出までの期間短縮技術の開発を検討している。遺伝子導入効率については、アグロバクテリウム法において感染時のエチレン発生を抑制したスーパーアグロバクテリウム法を検討した結果、従来法に比べ約1.3倍の遺伝子導入効率の向上が認められた。また、再分化したシュートにインドール酪酸(IBA)の添加による発根誘導により、形成される次世代の小球根が従来法に比べ約2倍に肥大化することが判明した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
(1)シスエレメント配列の解析： おおむね順調に進展している。当初の予定通り、iPCR法によりシスエレメントが存在する領域の絞り込みが進んでいる。チューリップおよびユリ共に新鮮な花を材料とするため、解析時期が限られるが、現在、チューリップでは2ヶ所の20 bp領域、ユリでも40 bp内に花弁特異性を示すシスエレメントの存在が示されている。
(2)プロモーター領域の定量化： おおむね順調に進展している。(1)で明らかとなった配列をルシフェラーゼ遺伝子に繋ぎLuc活性を測定している。ユリで先行しているが、シスエレメント配列の増加に比例して活性の増加が認められており、(1)で得られた結果を強くサポートしている。また、チューリップでの解析も現在進行中である。
(3)形質転換体の作出： おおむね順調に進展している。出発材料として主に花茎組織を用いた遺伝子導入を行っている。従来はパーティクルガン法およびアグロバクテリウム法であったが、遺伝子導入効率を高めるためスーパーアグロバクテリウム法を検討した結果、約1.3倍導入効率を高めることに成功した。また、チューリップでは形質転換体を維持するためには小球根形成が必須であるが、インドール酪酸（IBA)を用いてシュートの発根誘導を行うことで、従来に比べ約2倍の大きさの小球根が得られることが判明した。
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| Strategy for Future Research Activity |
(1)シスエレメント配列の解析： 現在同定されている領域について、更に4 bp～1 bpの欠失を導入し解析を進める。これにより1塩基単位でのシス配列を決定し、花弁特異性を示すシスエレメント配列を明らかにすると同時に、チューリップとユリでの違いも明らかにする。
(2)プロモーター領域の定量化： Luc活性を指標とした定量化を継続する。また、シスエレメントの塩基配列を人為的に改変し活性強化に繋げる。
(3)形質転換体の作出： 本年度効果が認められたスーパーアグロバクテリウム法による遺伝子導入、IBAによるシュートの発根誘導等を行い効率的な形質転換系の開発を継続する。
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| Causes of Carryover |
平成26年度は手持ちの試薬等が多く残っており、そちらを優先的に使用したため新規購入分が予定より少なくて済んだ。
特に研究代表者側で288,801円、研究分担者側で400,271円が次年度使用額となった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成27年度は直接経費1,300,000円と前年度未使用分687,072円を合わせ1,987,072円の予算で研究を進める。特に、本年度はMYBプロモーターのシスエレメントを１塩基単位で解析を進める予定であり、また、活性の定量的解析、形質転換体作出にも取り組むため、試薬等の購入に使用する。また、学会等で成果発表に努める予定である。
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