2015 Fiscal Year Research-status Report
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26450057
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| Research Institution | Yamaguchi University |
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Principal Investigator |
伊藤 真一 山口大学, 農学部, 教授 (30243629)
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2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | Fusariujm oxysporum / タマネギ / エフェクター / ＳＩＸ / 染色体 / 病原性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、タマネギ乾腐病菌のエフェクター（FocSIX3）がFOCの病原性因子であることを検証し、その作用メカニズムを解明することである。27年度の成果として、１）FocSIX3破壊株に加え、SIX3遺伝子相補株および過剰発現株を作製し、それぞれの病原性を比較した結果、FocSIX3破壊株では野生株に比べて病原性が低下したが、SIX3遺伝子相補株および過剰発現株では野生株と同等になることを確認した。２）上記の菌株をタマネギ幼苗に接種し、抵抗性応答において重要な役割を果たすシステインの生合成遺伝子の発現変化を調べた結果、SIX3タンパク質がシステイン生合成を抑制することが示唆された。３）大腸菌で生産した組換えFocSIX3タンパク質を用いてin vitroにおけるFocSIX3タンパク質（14kDa）のプロセシングを解析した結果、FOCがFocSIX3タンパク質（14kDa）を12 kDaにプロセシングするプロテアーゼを分泌していることが示唆された。４）次世代シーケンサーによるFOC ドラフトゲノム解析により、FOC のゲノムには、6個（FocSIX3、FocSIX5、FocSIX7、SIX9、SIX10、およびSIX12）のSIX遺伝子ホモログが存在し、このうち少なくとも4個（FocSIX3、FocSIX5、FocSIX7、およびSIX9）は4 Mb染色体に座乗していることがわかった。５）FOC ドラフトゲノムデータを用いてSIX以外のエフェクター遺伝子候補を探索し、その中から任意に選んだ5個のエフェクター候補遺伝子（g759、g1064、g1757およびg2174）について感染したタマネギ植物体内における発現を調べた結果、いずれも根および茎盤部において発現していることが明らかになった。６）上記５）のエフェクター候補遺伝子の染色体マッピングを行った結果、4個（g1064、g1757、g1908およびg2174）については弱病原性および非病原性FOCのゲノムには存在せず、強病原性FOCの4 Mb染色体に座乗していることが判明した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
１）FocSIX3の病原性への関与：FocSIX3破壊株および相補株を用いた接種試験により、FocSIX3遺伝子が病原性遺伝子であることを確認できた(達成度100％)。
２）FocSIX3タンパク質の作用メカニズム：本研究では、エピトープ予測ソフトを用いて合成したペプチドを抗原にして抗FocSIX3抗体を作製し、共免疫沈降法によってFocSIX3タンパク質と相互作用する宿主タンパク質を回収する計画であった。しかしながら、種々の実験結果から、作製した抗体の認識部位がFocSIX3タンパク質の内部にあることが判明し、共免疫沈降法では宿主タンパク質を回収できないことが明らかになった。そこで、大腸菌による組換えFocSIX3タンパク質を新たに調製し、これを抗原にして抗体を作製することにした（現在ウサギを免疫中）。このようなことから、FocSIX3タンパク質と相互作用する宿主タンパク質に関する研究の進展が予定よりも遅れている。（達成度20%）。
３）未知エフェクターの探索：次世代シーケンサーによるタマネギ乾腐病菌の未知エフェクター遺伝子の探索によって、SIX3ホモログ以外のタマネギ乾腐病菌特異的エフェクター遺伝子候補が明らかになり、それらがFOCの4 Mb染色体に座乗することがわかった（達成度：100％）。
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| Strategy for Future Research Activity |
FocSIX3タンパク質の作用メカニズムについては、１) 27年度に作製した組換えFocSIX3タンパク質を用いて、タマネギの根におけるシステイン生合成抑制作用を検証する。２) 組換えFocSIX3タンパク質を抗原にして抗血清を作製し、共免疫沈降法によってFocSIX3タンパク質と相互作用する宿主タンパク質を回収し、性質を明らかにする。また、同様の目的で、酵母two-hybrid法によるアプローチも行う。
FOC特異的エフェクターについては、FOCの4 Mb染色体に座乗している4つのエフェクター遺伝子候補の遺伝子破壊を行い、これらの機能を明らかにする。また、本染色体がFOCの病原性染色体である可能性についても検証を進めたい。
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