2016 Fiscal Year Research-status Report
オオムギ高親和性硝酸イオン輸送系の機能発現機構解明にむけた組織細胞学的アプローチ
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26450076
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| Research Institution | Niigata University |
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Principal Investigator |
末吉 邦 新潟大学, 自然科学系, 教授 (10216278)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | トランスポーター / 硝酸 / 細胞内局在性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、オオムギ根において低濃度の外部硝酸イオン吸収に関わる高親和性硝酸輸送系を構成する２つのタンパク質(HvNRT2およびHvNAR2)の機能発現機構について、組織細胞生物学的側面から明らかにすることを目的とする。２つのタンパク質は、硝酸イオン吸収の際に根の細胞膜上において何らかの相互作用をして機能すると予想されている。前年度までに、両タンパク質が根の皮層域における最も外側の細胞層の細胞膜上に共通して存在していることを免疫組織化学的に明らかにした。続いて、細胞膜から露出していると予測されるHvNRT2.1のC末端断片(HvNRT2.1c)およびHvNAR2.3の中央断片(HvNAR2.3cent)の相互作用をアフィニティーカラム法で解析したところ、両タンパク質断片がカラム内で相互作用することを明らかにした。さらに、HvNRT2.1の463番目のセリン残基がNAR2.3との結合に重要であることが示唆された。
28年度は、植物細胞内におけるHvNRT2.1とHvNAR2.3の相互作用を解析するために、Yongらの方法に従いBiFC法による解析を行った。すなわち、HvNRT2.1のN末端と分割黄色蛍光タンパク質(YFP)のN末端側との融合タンパク質(nYFP:HvNRT2.1)とHvNAR2.3のC末端と分割YFPのC末端側との融合タンパク質(HvNAR2.3:cYFP)をタマネギ表皮細胞において同時に発現させた。タマネギ表皮細胞において再構成されたYFPによる蛍光が細胞膜上に観察されたことから、HvNRT2.1とHvNAR2.3が相互作用して細胞膜上に局在することが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本研究は、オオムギ根のHATSを構成する２つのトランスポータータンパク質(HvNRT2およびHvNAR2）の機能発現機構を組織細胞生物学的側面から明らかにし、低窒素条件下での作物の窒素利用効率の向上技術に寄与できる分子基盤を提示することを目的とする。期間内で明らかにしようと計画している具体的項目は、1)オオムギ根組織内におけるHvNRT2.1およびHvNAR2.3の局在性の解明、2)HvNRT2とHvNAR2の相互作用に関係するアミノ酸残基の解明、3)インタクト植物細胞内におけるHvNRT2.1とHvNAR2.3の相互作用の解析、の３項目である。以上の計画のうち、28年度は項目3)を行い、BiFC法によりHvNRT2.1とHvNAR2.3が相互作用して細胞膜上に局在することを示すことができたが、2つのタンパク質が細胞膜に配置されるためにお互いの存在が必要であるのかまで明らかにできなかったため、やや遅れていると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
HvNRT2.1とGFPとの融合タンパク質(HvNRT2.1:GFP)およびHvNAR2.3とDsRedとの融合タンパク質(HvNAR2.3:DsRed)をタマネギ表皮細胞に個別に発現させ、２種の融合タンパク質が細胞内のどこで発現しているのかを調べる。これにより、個別のタンパク質単独で細胞膜に局在できるかが明らかになる。また、HvNRT2.1:GFPおよびHvNAR2.3:DsRedをタマネギ表皮細胞で同時に発現させ、緑色蛍光、赤色蛍光および両蛍光をマージさせた結果を観察する。これにより、2つのタンパク質が細胞膜に配置されるためにはお互いの存在が必要であるかが明らかにできる。最終的に、両タンパク質の相互作用は、細胞膜にターゲッティングされるために重要なのか、輸送活性発現に重要であるかが判断できる。
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| Causes of Carryover |
28年度は、他の資金と合わせて物品を購入することができたことに加え、研究の進展にやや遅れが生じ計画通りの経費執行ができなかったことから、次年度使用額として1,272,141円が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
29年度は補助事業期間を延長し、28年度に次年度使用額として生じた1,272,141円を使用する。内訳は、試薬・プラスチック製品などの物品費として922,141円、国内・国外旅費として200,000円、その他（委託分析等）として150,000円を使用予定である。
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Research Products
(1 results)
