2014 Fiscal Year Research-status Report
窒素固定細菌共生系における菌叢ダイナミクスモデルの構築と大気中窒素の転換
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26450085
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| Research Institution | Utsunomiya University |
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Principal Investigator |
前田 勇 宇都宮大学, 農学部, 准教授 (10252701)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 窒素固定 / 光合成細菌 / 細菌共生系 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
全世界のアンモニア生産は約1.6 億t であり、全アンモニア生産量の約8 割は肥料用として化学合成法であるハーバー・ボッシュ法により生産されている。その一方で、自然界において生物学的窒素固定反応（N2 + 8H+ + 8e- → 2NH3 + H2）により、全世界のアンモニア生産量と同等量のアンモニアが生成していると見積もられている。しかしながら、農業生産への生物学的窒素固定反応の寄与は、マメ科植物における根粒中の根粒細菌による窒素固定反応等に限定されているのが現状である。
そこで光合成細菌を主体とした光駆動性の窒素固定を持続させるために化学合成細菌との共生系を検討し、酸素ガスとアンモニアによるニトロゲナーゼに対する負の制御を回避することを目的に研究を行った。窒素固定活性の評価は、無機態および有機態窒素の欠乏下での細菌共生系の培養を行い窒素固定に依存した細胞増殖の有無で行った。化学合成細菌と光合成細菌のいくつかの種を組み合わせて植菌した結果、空気存在下において持続的な細菌の増殖が認められた。窒素固定能を有する光合成細菌単独の植菌を行った際には、同条件にて持続的な増殖が認められなかったことから、空気存在下、光合成細菌の窒素固定において化学合成細菌による酸素消費が重要な役割を担っていることが示唆された。共生系を構成する菌株の16S rRNA遺伝子部分配列をそれぞれ選択的に増幅するプライマーを用いて定量PCRを行い、増殖を各菌株由来DNAの量的変化により評価したところ、光合成細菌のみならず化学合成細菌の持続的増殖も確認された。
これらの結果から光合成細菌と化学合成細菌の共生系では、空気中の窒素ガスを基質とした窒素固定反応によりアンモニアが生成し、共生系の窒素源となって増殖を支えていることが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成26年度においては、光合成細菌と化学合成細菌の種々の組み合わせを検討した結果、窒素固定に依存した細菌共生系の持続的増殖を確認することができた。この結果から、光合成細菌を主体とした光駆動性の窒素固定を持続させるための化学合成細菌との共生系の構築と、酸素ガスとアンモニアによる窒素固定酵素（ニトロゲナーゼ）に対する負の制御の回避を達成することができたと考えられる。平成27年度以降の研究においては、構築された共生系に対して更なる解析や、培養工学的な制御法を検討していくことができる。これらの状況から、研究は計画通りにおおむね順調に進展していると判断される。
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| Strategy for Future Research Activity |
・共生系の窒素固定とニトロゲナーゼの遺伝子の定量的解析
窒素固定に依存したバイオマスの増加が、ニトロゲナーゼの触媒作用によるものであることを明らかにし、系全体の窒素固定反応速度の経時的変化を調べるために、サンプリングされたバイオフィルムと培養液中の全窒素量をケルダール法にて測定する。また、サンプリングされたバイオフィルムのメタゲノムにおいて、rRNA遺伝子に対するニトロゲナーゼの遺伝子（nifH）の量比を求めることにより、窒素固定反応を定量的に捕らえる。
・菌叢ダイナミクスモデルの構築
窒素固定細菌共生系が構築されていく過程における菌数と菌叢の変化を、16S rRNAを指標とした定量PCRと16S rRNAの遺伝子塩基配列の網羅的解析により明らかにしていく。パイロシークエンシングと、バイオインフォマティクスにより得られた塩基配列データのOperational Taxonomic Unitへの振り分けを通じて菌叢の変化を把握する。これらの手法を通じて、菌体増殖、多様性の増加、定常状態への移行、化学合成細菌と窒素固定細菌のバランス、属・種の置換等が生じているかどうかを解析する。さらに、窒素固定活性の変化と菌数・菌叢の変化とを関連づけすることで、環境因子によって変動するダイナミクスモデル構築に結びつける。
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| Causes of Carryover |
窒素固定細菌共生系の構築において、組み合わせる菌株の種類を確保するために菌株保存機関からの菌株購入費用や自然界からの菌株単離のための旅費を見込んでいた。しかしながら、研究室が保存する種々の菌株を組み合わせることにより細菌共生系が構築されたため、当初想定していた費用において残額が生じる結果となった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
細菌共生系の動態をより詳細に解析するために、共生系細菌由来の16S rRNA遺伝子やnif遺伝子の塩基配列の決定や、共生系の窒素固定活性の定量のためのアッセイの費用に使用する計画である。
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