2015 Fiscal Year Research-status Report
好熱菌における酸化還元補酵素安定化戦略の解明とインビトロ代謝工学への応用
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26450088
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
本田 孝祐 大阪大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (90403162)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 補酵素 / 好熱菌 / 耐熱性酵素 / サルベージ合成 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
前年度までに酸化型ニコチンアミド補酵素であるNAD+を対象にその熱分解産物（ニコチンアミドおよびADP-リボース）を同定した。また、これらを出発物質としたNAD+のサルベージ合成を担う一連の酵素群をT. thermophilusより同定した。H27年度は、その初発反応を担うニコチンアミダーゼについて詳細な特性評価を行った。この結果、本酵素はニコチンアミドに対し、非常に低いKmを示す（すなわちニコチンアミドに対する高い親和性を有する）ことを見出した。この値は、すでに生理的機能が解明されている他生物由来のニコチンアミダーゼと比較しても同等かそれ以下のものであった。さらに同酵素が一連の合成経路の最終産物であるNADHによりフィードバック阻害を受けることを明らかにした。これらの結果は、本酵素が生理的環境下においてもニコチンアミド補酵素サルベージ合成を担う酵素のひとつであることを強く示唆するものである。
また、一連のサルベージ合成酵素群を用い、当該経路をin vitroで再構築することに成功した。この結果、60℃におけるNAD+の見かけの安定性を15時間に渡り保つことが可能となった。
さらには還元型補酵素であるNADHの熱分解産物の同定にも着手し、NADHが酸化型であるNAD+を経由して分解されること、また得られるNAD+のおよそ25%は通常生体内で補酵素として用いられるそれ（β-NAD+）とは異なる立体構造をもったα-NAD+であることを見出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
前年度までにNAD+サルベージ合成酵素群の同定に成功したことを受け、当該年度も当初計画以上に研究を進捗させることができた。具体的には、本課題の大きな目標のひとつであるin vitroでのサルベージ合成経路の再構築とこれによる高温環境下でのニコチンアミド補酵素の安定化技術開発に成功し、その成果を国際科学誌、国際学会等で発表することができている。さらには還元型補酵素であるNADHのサルベージ合成に関する検討を前倒しで開始することもできており、この結果、α-NAD+に代表される分解産物の一部を同定することにも成功している。
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| Strategy for Future Research Activity |
(1) これまでの成果で、T. thermophilusには当該年度までに同定したものとは異なるNAD+サルベージ合成経路が存在することを示唆する結果を得ている。このバイバス経路を担うであろう酵素、具体的にはニコチンアミドのホスホリボシル化酵素の同定に取り組む。
(2) NADHの熱分解産物としてβ-NAD+に加え、その異性体であるα-NAD+を同定することができた。これまでの報告によれば、α-NAD+には重要な生理的役割は知られておらず、ニコチンアミド補酵素の安定的利用のためには本物質を速やかにβ-NAD+もしくはNADHへと再合成する反応が必要だと考えられる。そこで好熱菌におけるNADHサルベージ合成経路の全容解明に向けた足がかりとしてH28年度はα-NAD+に着目し、本物質をサルベージ合成反応の中間体（ニコチンアミド、ADP-リボースなど）へと積極的に分解する酵素、あるいはα-NAD+からβ-NAD+への異性化を担う酵素などに焦点を絞り、これらを好熱菌より探索する。
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| Causes of Carryover |
当該年度は物品費については当初予算額と同程度の支出となった。また分析機器（ガスクロマトグラフィー）の予期せぬ故障のため修理費用として役務の支出が予定より大きくなった。一方で本課題の成果発表のため従前より参加を予定しておった国際会議より、招待講演の機会をいただくこととなったため、当該会議の参加費（3000ドル）が支払免除となった。これにより次年度への繰り越し金が発生した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
H28年度はNADHサルベージ合成酵素群の探索作業のため、α-NAD+などの希少な試薬を多く使用することとなる。これらの試薬購入費として繰り越し金を活用し、スムーズに研究を進捗させる。
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Research Products
(4 results)
