2014 Fiscal Year Research-status Report
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26450098
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| Research Institution | Kagoshima University |
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Principal Investigator |
九町 健一 鹿児島大学, 理工学研究科, 准教授 (70404473)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 窒素固定 / 共生 / 遺伝子発現 / アンモニア / DNA分解酵素 / 形質転換 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ニトロソグアニジンを変異原として単離された、6株のフランキアCcI3株の窒素固定変異体候補の特徴づけを行った。すべての変異株は、アンモニアを含む培地では生育したが含まない最少培地で生育しなかった。4株について窒素固定活性を測定し、うち3株はほぼ活性がなかった。4株はベシクル形成に異常を示した。一部の株は、宿主植物との共生に異常を示した。γ線を変異原として用いて、約3200コロニーをスクリーニングした結果、新たな変異株候補を17株単離した。γ線はフランキアにおいて効率のよい変異原であることがわかった。ノーザンブロットにより窒素固定関連遺伝子のオペロン構造を決定しようと試みたが、発現量が低く明瞭なシグナルが得られなかったため、不完全な予測にとどまった。
フランキアの形質転換を阻害していると考えられる、DNA分解酵素の特徴づけを行った。切断部位は不特定である、メチル化塩基をまったく含まないDNAも分解する、分解活性にはマグネシウムイオンとGTPの加水分解を要求する、クエン酸で活性が阻害されることなどがわかった。このような特徴をあわせもつ制限酵素はこれまで報告がない。イオン交換クロマトグラフィーにより、酵素を部分的に精製した。様々なフランキア株の粗抽出液を調べた結果、ハンノキグループ株はDNA分解活性を持たないことがわかった。
フランキアACN14a株の継代培養液中に、異なるコロニー形状を示す２種類の細胞系統（AとS）が混在することを発見した。S型の株は宿主植物に根粒は着生するものの、窒素固定活性が低く、植物の生長を促進しなかった。細胞中の糖の組成を解析したところ、S型はA型に比べてマンノースと2-O-メチルマンノースの含量が低かった。後者は、細菌界でもフランキアが特異的に含む希少糖であり、細胞表層に存在することが分かっている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
変異株の特徴づけのうち、ベシクル形成の詳細に関わるもの（ホパノイド脂質の解析、菌糸分岐の解析）以外はおおむね完了し、候補株がすべて真の窒素固定変異株であることが確認できた。フランキアで窒素固定変異株を単離した例は、これが初めてである。γ線は、これまで試した変異原のなかで最も変異株の出現頻度が高く、期待以上の数の変異株を単離することができた。しかし、窒素固定オペロンの構造解析は、mRNAの発現量が予想以上に低かったため、うまくいかなかった。
DNA分解酵素の認識配列は、以下の理由で特定できなかった；切断部位が不特定だった、前例のないタイプの酵素だったためゲノム情報からの遺伝子予測ができなかった。また、タンパク質粗抽出液を用いたDNAメチル化もうまくいかなかった。しかし、生化学的な精製が可能そうであり、次年度以降に遺伝子が同定できると考えている。
当初は計画していなかったが、フランキアACN14a株において、共生時の窒素固定能に異常を示す変異株が単離できた。細胞表層の多糖の構造が変化していると推測される。根粒菌や病原性放線菌では、細胞表層多糖が宿主生物との相互認識に関わることが知られており、フランキアで見つけた現象もそれらに類するものかもしれない。新たな研究の展開が期待できる。
予定通りに進まなかったこともあったが、予期しない進展も見られたことから、おおむね順調に進展していると考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
窒素固定変異株について：γ線により単離した窒素固定変異株についても、グロース、ベシクル形成、窒素固定活性について調査し、特徴づけを行う。加えて、主要な窒素固定関連遺伝子のアンモニア欠乏下での発現を調べる。以上の結果を論文にまとめて投稿する。復帰変異株のスクリーニングを行う。変異株と復帰変異株のゲノム解析を行い、変異表現型を引き起こす遺伝子を同定する。5'RACE法により窒素固定オペロンの転写開始点を同定する。転写開始点上流配列をプローブとして用いたゲルシフト解析により、転写因子が結合するシス配列を同定する。凍結保存しておいた変異細胞を用いて、共生のできない変異株をスクリーニングする。
形質転換について：DNA分解酵素を精製し、質量分析により遺伝子を同定する。近傍から対応するメチル化酵素を探し、大腸菌で組換えタンパク質を作り、それによりメチル化したDNAにより形質転換を行う。DNA分解活性を持たないフランキア株に対して形質転換を行う。
細胞表層多糖変異株候補について：細胞表層多糖を精製し、A型とS型とで糖組成の違いを調べる。両型のフランキアを接種した植物の生長、窒素固定活性、根粒数を調べ、生育の差を定量的に評価する。根粒内部の顕微鏡観察を行い、感染細胞の頻度やベシクル分化の程度を調べる。ゲノム解析を行い、2つの型の表現型の違いを引き起こしている遺伝子の候補を探る。
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