2014 Fiscal Year Research-status Report
放射線抵抗性細菌の遺伝子導入による高度好熱菌への放射線耐性付与
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26450103
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| Research Institution | Toyo University |
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Principal Investigator |
鳴海 一成 東洋大学, 生命科学部, 教授 (90343920)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 遺伝子発現 / DNA修復 / 高度好熱菌 / 放射線抵抗性細菌 / タンパク質改変 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
耐熱性カマナイシン耐性マーカーを持つT. thermophilusのゲノムインテグレーションベクターpT8S-P31を制限酵素NdeI及びBamHIで切断後、アルカリホスファターゼ処理によってDNA5’末端の脱リン酸化を行った。次に、D. geothermalis PC6株のゲノムDNAを鋳型としてNdeI及びBamHI認識配列タグ付きPCRプライマーを用いてpprA遺伝子領域をPCRにて増幅した。このPCR産物をNdeI及びBamHIで切断したDNA断片と上記のゲノムインテグレーションベクターをDNAリガーゼによって連結した。このDNAを用いて大腸菌JM109株を形質転換し、カマナイシン耐性の形質転換株を取得した。次に、形質転換株から抽出したプラスミドpT8S-P31-pprAを用いてT. thermophilus HB27 HT104 (pTT8)株を形質転換することでカマナイシン耐性の形質転換株を取得し、P31pprA株と命名した。この菌株のゲノムDNAを抽出し、pprA遺伝子領域をPCR増幅することで、pprA遺伝子がT. thermophilusのゲノムに挿入されたことを確認した。また、pprA遺伝子を挿入としていないゲノムインテグレーションベクターpT8S-P31のDNAでT. thermophilusを形質転換することで、カマナイシン耐性のネガティブコントロール株P31株を取得した。
作製したT. thermophilus P31pprA株及びP31株の60℃での増殖曲線を解析した結果、測定したすべての培養時間においてP31pprA株の生菌数がP31株の生菌数を上回っており、pprA遺伝子のゲノム挿入による生育の促進効果が認められた。このことから、培養温度60℃においても、pprA遺伝子がT. thermophilusの細胞内で発現していることが強く示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初予定していた自己複製プラスミド型のT. thermophilusベクターを研究開始時に入手できなかったが、ゲノムインテグレーションベクターpT8S-P31に目的遺伝子を連結する方法に変更することで、順調に計画を達成することができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
今回作製したT. thermophilus P31pprA株において、D. geothermalis由来のpprA遺伝子が発現している可能性が強く示唆されたが、タンパク質レベルでの検出には至っていない。この理由として、ウエスタンブロット解析で使用した抗体の特異性に問題があるのではないかと考えられた。そこで今後は、抗D. geothermalis PprA抗体を作製し、ウエスタンブロット解析に用いる予定である。また、P31pprA株およびP31株の各種変異原（ガンマ線、紫外線、マイトマイシンC、ブレオマイシン、過酸化水素など）に対する耐性を評価する予定である。
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[Journal Article] Draft genome sequence of Bacillus alcalophilus AV1934, a classic alkaliphile isolated from human feces in 19342014
Author(s)
Oliver Attie, Anitha Jayaprakash, Hardik Shah, Ian T. Paulsen, Masato Morino, Yuka Takahashi, Issay Narumi, Ravi Sachidanandam, Katsuya Satoh, Masahiro Ito, Terry A. Krulwich
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Journal Title
Genome Announcements
Volume: 2 (6)
Pages: e01175-14
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Presentation] Space exposure experiment of microbes at the international space station proposed in “Tanpopo” mission2014
Author(s)
Shin-ichi Yokobori, Yuko Kawaguchi, Yinjie Yang, Hirofumi Hashimoto, Nobuhiro Hayashi, Kensei Kobayashi, Kazumichi Nakagawa, Issay Narumi, Kaori Tomita-Yokotani, Satoshi Yoshida, Hajime Yano, Akihiko Yamagishi
Organizer
The Asia Oceania Geosciences Society 11th Annual Meeting (AOGS 2014)
Place of Presentation
ロイトン札幌（北海道札幌市）
Year and Date
2014-07-28 – 2014-08-01
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[Presentation] The possible interplanetary transfer of microbes: Assessing the viability of Deinococcus spp. under the ISS environmental conditions for performing exposure experiments of microbes in the Tanpopo mission2014
Author(s)
Yuko Kawaguchi, Yinjie Yang, Narutoshi Kawashiri, Keisuke Shiraishi, Masako Takasu, Issay Narumi, Katsuya Satoh, Hirofumi Hashimoto, Kazumichi Nakagawa, Yoshiaki Tanigawa, Yoh-hei Momoki, Maiko Tanabe, Tomohiro Sugino, Yuta Takahashi, Yasuyuki Shimizu, Satoshi Yoshida, Kensei Kobayashi, Shin-ichi Yokobori, et al.
Organizer
Origins 2014 International Conference
Place of Presentation
奈良県新公会堂（奈良県奈良市）
Year and Date
2014-07-06 – 2014-07-11
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