2015 Fiscal Year Research-status Report
スフィンゴ脂質の経口投与による疾病の予防・抑制と腸内細菌によるその効果の増強
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26450104
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| Research Institution | Meiji University |
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Principal Investigator |
浅沼 成人 明治大学, 農学部, 准教授 (50366902)
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2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 腸内細菌 / プロバイオティクス / スフィンゴ脂質 / セラミド / グルコシルセラミド |
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| Outline of Annual Research Achievements |
セラミドは種々の効果をもつ生理活性物質であるが希少なため、その前駆体であるグルコシルセラミド(GluCer) が一般的には用いられている。しかし、GluCerは摂取しても腸管から吸収されにくいし、また皮膚からの透過性も低いので化粧品やアトピー性皮膚炎の治療には効果が低い。それ故、GluCerからセラミドを生成する腸内細菌を見つけ出し、その菌を用いてセラミド生成を増加させ、種々の病気の予防・治療に役立てることを目標とした研究を行った。初年度の成果として、GluCer水解能の高い腸内細菌の探索を行い、候補菌を単離したことを報告した。本年度は、候補菌の再分離を繰り返すことで単一であることを確認し、更に菌の特性を解析した。この結果、16SrRNA遺伝子の相同性からは、Clostridium coccoidesグループに属する新規の菌であると考えられた。芽胞形成能はないと考えられ、利用できる糖基質の種類が少ないことが明らかになった。また、GluCerの分解産物がセラミドであることをTLC及びGC-MS解析により確認した。本菌のプロバイオティクス利用が食餌性GluCerの利用に及ぼす影響を動物試験により検討した。すなわち、GluCer単独投与時またはGluCerと新規単離菌の同時投与時を比較したところ、菌との同時投与によりGluCerの利用効率が増加する傾向が見られた。そこで、本菌の経口投与により食餌性GluCerの利用が増加する可能性があると思われた。また、植物サンプルから粗GluCerを抽出する方法を検討した。更に、回収した粗GluCerの存在下で新規菌を培養し、生成されたセラミドを精製・回収する方法についても検討した。次年度には、回収したセラミドと粗GluCerの生理効果を動物試験で比較する予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本研究については、4つのテーマに分けて進めているが、実験1のテーマである“GluCer水解活性の高い新規の腸内細菌の探索と単離”では、昨年度の結果を進展させ、単離菌がGluCerからセラミドを生成することや単一であることを精査し、新規性の高い菌であることを示した。従って、目的を大旨達成し、本菌を用いて残り3つのテーマを進めることが可能になったと思われた。しかし、GluCer分解能を持つ菌が他にも存在すると思われるので、新たな候補菌の単離は継続する必要があると思われた。
また、実験2のテーマである“新規GluCer水解菌の特性解析によるセラミド製造法の確立”として、単離菌の培養特性について解析し、糖基質利用性、アミノ酸要求性、ミネラル要求性、ビタミン要求性、嫌気度、芽胞形成の有無などを明らかにし、in vitroでのGluCer生成に適した条件について検討し、実際に菌を用いてのセラミドの調製を試みた。ある程度のセラミドを回収することができたので、こちらもある程度の成果は得られたと考えられた。しかし、より効率的なセラミド回収方法を検討するなどの課題も残った。
実験3のテーマである“新規GluCer水解菌のプロバイオティクス利用の検討”として、本菌のプロバイオティクス利用について、動物試験により検討した。菌の投与により、食餌性GluCerの利用が増加する傾向が見られたので、早期に再試験などにより確証する予定である。次年度は、実験的大腸炎や大腸がんへの影響を解析する予定である。
実験4のテーマである“GluCer水解酵素の精製と遺伝子のクローニング”については、今年度は進展させることができなかったので、次年度に精力的に進める必要があると思われた。
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| Strategy for Future Research Activity |
実験1と実験2のテーマについては、これまでにある程度の進展は見られたので、今後は実験3と実験4のテーマを精力的に進めていくことを考えている。
実験3として、先ずは単離菌の投与により、食餌性GluCerの利用が増加することを再確認し、早期に結果としてまとめる予定である。また、実験2で検討したような方法で、ある程度の量のセラミドを調製している。これを用いて、実験的大腸炎に対するセラミドとGluCerの影響について調べることを計画している。薬剤により実験的大腸炎を誘発したマウスにセラミドまたはGluCerを経口投与し、糞の形状、腸管上皮細胞の形態、血中イムノグロブリン量などを観察することで、セラミドによるIBDの予防・抑制効果を検討する。また、薬剤により大腸での異常陰窩病巣の形成を誘発したマウスおよびラットにセラミドまたはGluCerを経口投与し、異常陰窩病巣の形成が抑制されるかどうかを観察し、大腸癌の予防・抑制効果を検討する。必要な量のセラミドとGluCerについては、順次調製していく予定である。
実験4のテーマでは、GluCer水解酵素の精製が第一目標となるが、こちらは今年度は進められなかったので、昨年に記載したことが当面の目標となる。すなわち、GluCer水解酵素のカラムクロマト法によるGCaseの精製を試みる。二次元電気泳動等によりある程度の単一性が確認されたら、MS/MSを用い、精製したGCaseタンパクのペプチド断片の情報（分子量やアミノ酸配列）を得て、他の酵素タンパクとの類似性を調べる。また、得られたアミノ酸配列を基に遺伝子プローブを作成し、遺伝子ライブラリーから目的遺伝子の同定を試みる。
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| Causes of Carryover |
実験の進捗状況に遅れがあるため、当初の計画よりも実験作業が次年度に延期になった部分がある。この未使用分を次年度に使用することを希望する。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
設備備品は既にあるものを利用する予定であり、その使途はなく、すべて消耗品として計上する。
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