糸状菌分生子特異的hydrophilin遺伝子の光による発現制御機構の解明

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26450108
• Research Institution: National Agriculture and Food Research Organization
• Principal Investigator: 鈴木 聡 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 食品研究部門食品生物機能開発研究領域, 上級研究員 (90353979)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 光応答 / 糸状菌 / hydrophilin

Outline of Annual Research Achievements

糸状菌無性胞子（分生子）中には、光により高発現する機能未解明のタンパク質が数多く含まれる。我々はAspergillus nidulansの光誘導分生子タンパク質Conが、植物種子の成熟乾燥過程で高発現するタンパク質に類縁のhydrophilinに分類され、かつ、栄養菌糸では短時間の光照射に応じて一過的に発現上昇する事を見出したが、その光による発現制御機構は不明である。そこで、con遺伝子上流の光応答因子結合配列に結合するタンパク質複合体を同定することで、これら遺伝子の発現制御機構を明かにすることを目的に以下の実験を行った。26年度に明らかになった光応答因子結合DNA配列と核タンパク質との結合バッファー条件を用いて、核タンパク質とビオチン化プローブDNAを混合し、ストレプトアビジンビーズを用いたDNAアフィニティー沈殿法により結合タンパク質複合体を回収した。回収したDNA結合タンパク質をSDSPAGEにて分離し、銀染色にて検出した。バンドを切り出し、ゲル内トリプシン消化を行った。ペプチドMSフィンガープリンティングにより、結合タンパク質候補を得た。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

MS解析を海外の連携研究者に依頼したため、条件検討のためのやりとりに予想外の時間がかかった。

Strategy for Future Research Activity

１．ペプチドMSフィンガープリンティングにより同定されたタンパク質の遺伝子をA.nidulansのゲノムデータベースより検索し、PCRにて遺伝子断片を取得し、クローニングする。２．無細胞タンパク質合成キットにてリコンビナントタンパク質を合成する。３．EMSAにて各タンパク質と光応答因子結合配列との相互作用を確認する。４．FRETあるいはBiFC、あるいはその組み合わせによる3者間相互作用観察により、タンパク質間相互作用をin vivoで観察確認する。５．上記により、光応答因子複合体の構成タンパク質と確認された物について遺伝子破壊株及び過剰発現株を作成し各株における既知hydrophilin遺伝子発現をノザンブロットで解析する。

Causes of Carryover

次年度使用額は研究費を効率的に使用して発生した残額である。

Expenditure Plan for Carryover Budget

残額については平成28年度の研究費と併せて試薬・消耗品として使用する。