2014 Fiscal Year Research-status Report
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26450121
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| Research Institution | Gifu University |
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Principal Investigator |
中川 寅 岐阜大学, 応用生物科学部, 准教授 (10281049)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | (プロ)レニン受容体 / プロセシング酵素 / プロテアーゼ / ATP6AP2 / V-ATPase / バイオマーカー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は，臓器障害の新規バイオマーカーとして近年注目されている可溶型(プロ)レニン受容体（可溶型PRR）について，その生成機構を明らかにすることを目的としている。可溶型PRRは，膜結合型（全長型）PRRが細胞内プロテアーゼ（プロセシング酵素）によって限定的に切断されて生成する。可溶型PRRを生成するプロセシング酵素として，これまでにfurinとADAM19が報告されているが，これらの働きでは十分に説明できないデータが存在している。そこで本研究では，研究代表者が予想する第3のプロテアーゼが可溶型PRR生成に関わるプロセシング酵素である可能性を検証する。
平成26年度，候補プロテアーゼが可溶型PRR生成に関与しているかどうか検討し，次の結果を得た。（１）遺伝子導入によって，ヒト培養細胞HEK293Tに全長型ヒトPRRを単独，もしくは候補プロテアーゼと共に発現させた。その結果，候補プロテアーゼとの共発現において，可溶型PRRの生成効率が上昇した。（２）研究代表者が樹立したCHO/hPRR-10His細胞では，内在性の細胞内プロテアーゼによって可溶型PRRが作られている。この細胞に，候補プロテアーゼを標的とするsiRNAを導入した結果，可溶型PRR生成量が減少した。また，（３）この細胞を，furin阻害剤，ADAM阻害剤，もしくは候補プロテアーゼ阻害剤で処理した結果，furin阻害剤と候補プロテアーゼ阻害剤とで可溶型PRR生成量が減少した。ADAM阻害剤による目立った影響はなかった。これらの結果は，可溶型PRRの生成に候補プロテアーゼが関与していることを強く示唆している。さらに阻害剤を用いた詳細な解析の結果から，可溶型PRRは，先ず候補プロテアーゼが全長型PRRを切断し，次いでfurinが作用するという２段階プロセシングを経て生成するというモデルを構築するに至った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究計画に沿って，遺伝子導入による候補プロテアーゼとの共発現実験，siRNAを用いた候補プロテアーゼのノックダウン実験，プロテアーゼ阻害剤を用いた阻害実験を行い，候補プロテアーゼの関与を強く示唆する結果が得られている。さらなる解析の結果，可溶型PRRは，先ず候補プロテアーゼが全長型PRRを切断し，次いでfurinが作用するという２段階プロセシングを経て生成するというモデルを構築するに至った。一方，切断部位を特定する目的でPRRの膜結合断片の精製を試みたが，十分量の目的タンパク質は得られず，切断部位の特定には至らなかった。切断部位の特定は，別の手法を検討することとした。
全体的には，交付申請書に記載の研究計画に沿って，おおむね順調に進展していると判断している。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成26年度，可溶型PRRの生成には，候補プロテアーゼとfurinの２つのプロセシング酵素が段階的に働いていることが示唆された。これらの可溶型PRRを識別するためのツールとして切断部位特異的抗体を作製（外部委託）する。得られた抗体が使用目的に叶う性質を備えているかどうか，大腸菌ならびに動物細胞で発現させた組換えタンパク質を用いて，ウエスタンブロット法（転写膜上の標的タンパク質の検出）ならびに免疫蛍光抗体法（細胞内の標的タンパク質の検出）によって評価する。
切断部位特異的抗体を用いて，可溶型PRRが，いつ，どこで作られ，どのように分泌されるかを，CHO/hPRR-10His細胞を用いて明らかにする。PRRは主として小胞体に局在しており，ゴルジ体で可溶型に変換後，分泌されると考えられている。研究代表者のこれまでの実験結果を考え合わせると，全長型PRRの小胞体からゴルジ体への輸送，ならびに切断後の可溶型PRRの細胞内輸送は，何らかの調節を受けていると考えられる。このことを念頭に，以下の実験を進める。①可溶型PRRがどこで作られるかを明らかにするため，切断部位特異的抗体とオルガネラ・マーカーとで細胞を二重染色し，蛍光顕微鏡を用いて細胞内分布を解析する。②可溶型PRRの生成を経時的に解析する。可溶型PRR生成の経時変化は，切断部位特異的抗体を用いたウエスタンブロット法，ならびに免疫蛍光抗体法で解析する。③可溶型PRRの生産量がどのような条件で変化するか，様々な薬剤で細胞を処理し，その影響を免疫蛍光抗体法で評価する。
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| Causes of Carryover |
当初，特殊抗体（切断部位特異的抗体）作製（外部委託）のための費用90万円を平成26年度に予算計上していた。しかし，切断部位の特定に至らなかったこと，加えて，候補プロテアーゼとfurinが作用するという可溶型PRR生成における２段階プロセシングモデルを検証する必要が生じた。そこで平成26年度内の抗体作製を見送ったために，次年度使用額（約80万円）が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
前述したように次年度使用額は，特殊抗体作製（外部委託）が次年度にずれ込んだことによるものである。特殊抗体は既に作製委託済みであり，研究実施計画を遂行するためには，次年度使用額と翌年度請求額との合計額が必要である。
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