2014 Fiscal Year Research-status Report
ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼの制御機構の解明
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26450126
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
廣政 恭明 九州大学, (連合)農学研究科(研究院), 准教授 (40291934)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | タンパク質の動的構造変化 / アロステリック効果 / 機能制御 / 時間分割蛍光 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の中心課題は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体をリン酸化する特異的キナーゼの制御機構の解明を目指し、制御因子がキナーゼ(PDK1とPDK2)に及ぼす動的構造変化の解明を試みるものである。動的構造変化の解明には、内在Trpを利用した時間分割蛍光分光法を用いる。そのためには、これまで研究代表者が明らかにしてきたPDK2について、まず試料の計測系への最適化を行った。手法としては、制御因子を添加した際の蛍光変化について、定常光を用いた蛍光スペクトル解析、時間分割蛍光解析(蛍光寿命と時間分割蛍光異方性)を用いた。PDK2には、３つのTrpが存在し、スペクトル解析から、それぞれの蛍光成分を抽出することが可能となった。さらに、時間分割解析と蛍光のエネルギー移動(FRET)解析から、ヌクレオチドとピルビン酸が添加された際に、Trp383の運動性が大きく高まること、すなわちクロスアーム構造の解放が明らかとなった。さらに、Trp383を含むC末端構造の動的変化を確認するために2重変位体を作成し発現を試みたが、封入体への移行が確認された。このため、PDK2の中心部に存在するTrpの変異を導入しない変異体を用い、制御因子の添加に伴う動的変化を調べる予定である。PDK1については、制御因子との相互作用はPDK2よりも、いくらか低いものであった。特にヌクレオチドとピルビン酸の協同性については、PDK2に比べ低いことがわかった。また、ヌクレオチドとピルビン酸の添加によりリポイルドメインから解離した。これらPDK1の結果を、現在まとめており、公表する予定である。また、PDK1について蛍光時間分割解析に研究を進めていく予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
PDK1の制御因子による構造変化について、蛍光に関する情報、ピルビン酸デヒドロゲナーゼとの相互作用に関する情報を得ている。動的構造変化の解明には、内在Trpを利用した時間分割蛍光分光法を用いるが、PDK2を用いた研究では制御因子による変化を観測することができた。さらなる解析を試みるために2重変位体を用いた研究を実施したが、発現に封入体へのタンパク質の移行が見られた。このため、別種の変位体を作成することにより、目標を達成する予定である。PDK2を用い研究よりPDK1に対しても時間分割蛍光分光法が有効であることが、確認された。PDK1については，本年度、時間分割蛍光分光法に研究を進める予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度は、PDK1の制御因子による構造と機能の変化について、予定通り阻害剤による構造変化を測定する予定である。また、PDK1とPDK2の制御因子による動的構造変化について時間分割蛍光分光法を用いた解明についても実施する。26年度では、PDK2の変異体の発現について問題があった。これに関しては、別種の変異体を作成することにより、目標を達成する。本年、米国のグループから、軽水・重水置換を利用した構造変化測定法が提案された。本研究の構造変化測定は、Trp蛍光を使用しているため、全体構造の変化を観測することが困難である。軽水・重水置換を利用した構造変化測定についても共同研究者とともに、試行する予定である。
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| Causes of Carryover |
平成27年3月開催の農芸化学会本大会においての学会発表の予定が困難になったため、その金額が、未使用金額となった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
成果発表に関しては、5月に開催される農芸化学会支部例会での発表（講演）が確定している。また、本年度の学会本会での発表を予定している。
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