2014 Fiscal Year Research-status Report
構造情報を基盤としたＦＭＮ結合反応の多重解析と分子進化的考察
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26450131
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| Research Institution | Osaka City University |
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Principal Investigator |
北村 昌也 大阪市立大学, 大学院工学研究科, 教授 (20244634)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中西 猛 大阪市立大学, 大学院工学研究科, 講師 (20422074)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | フラボタンパク質 / タンパク質工学 / 構造機能相関 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
平成26年度は、1. FMN結合タンパク質(FMN-bp)、フラボドキシン(Fld)及びフラボレドキシン(Flr)の変異体の作成、2. FMN-bp、Fld及びFlrの蛍光滴定法による解離定数(Kd)の測定、3. FMN-bp、Fld及びFlrの表面プラズモン共鳴(SPR)法によるKdの測定、4. FMN-bp、Fld及びFlrの等温滴定型熱量測定(ITC)法によるKdの測定を行う予定であった。
1. については、FMN-bpに存在する31Thr-Trp-Asn配列について、T31S、T31V、W32G、W32Y、W32A、W32F、W32H、N33Q、及びN33Dという合計9個の変異体遺伝子を取得できた。また、これらを発現ベクターに組み込み、発現タンパク質の存在確認を行った。
2. から4. については、アポタンパク質の調製法が最大の課題であった。すなわち、フラボタンパク質は酸性条件下でアポ化する性質を利用して、10%トリクロロ酢酸(TCA)溶液を用いて変性させた後アポタンパク質を沈澱画分として分離し、ジエチルエーテルを用いて十分にTCAを除いた後、緩衝液に溶解させる事によりアポタンパク質を得ていた。しかし、特に変異体タンパク質の場合、多くが不溶化したり、FMN結合能を失ったりした。そこで、変性剤として8M尿素を用いて、より温和な条件でアポ化し尿素を徐々に除いていくことにより再生させる条件を検討したところ、ほぼすべてがFMN結合能を有したアポタンパク質溶液として得られる事がわかった。そこで、このアポタンパク質を用いて、蛍光滴定法およびSPR法により、Kdの測定を行い、十分に信頼のおけるデータを取得する事ができた。現在、Fld及びFlrについて、この実験系が機能するか確認中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究はおおむね順調に進展している。
研究実績の概要のうち、1. および2. は完全に達成できた。3. については、Fld及びFlrのアポ化条件の検討が遅れているため、すべてを達成できたとは言えないと考えている。しかし、この点は、ほどなく結果が得られるものと考えている。
多少遅れている点として、4. のITC法によるKdの測定が挙げられる。この実験を平成26年度中に行う予定であったが、現在まだ行えていない。研究協力者が所属する東京大学に、この分析機器が設置されていることが主な原因である。すなわち、大阪から出張して必ず確かな結果が得られなければ、予算及び時間ともに大きな損失となるので、特にタンパク質の変性条件とその安定性の検討を慎重かつ綿密に行なう必要があった。そのため、計画よりも時間を要してしまった。また、一度の出張で、できるだけ多くの実験を行いたいと考えているので、少なくともFld及びFlrのアポ化条件も確立してから、取りかかりたいと考えている。
もう1つ遅れている原因として、実験を手伝ってくれる学生の教育に若干手間取ったことも挙げられるかもしれない。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成27年度は、1. イオン強度（特にリン酸イオン濃度）の影響、2. 変異体を用いた網羅的解析、3. X線結晶構造解析、4. Pseudomonas由来のFldの阻害剤の設計を計画していた。
平成26年度は、実験を手伝ってくれる学生として卒論生が2人及び前期博士課程大学院生1名の体制で行っていたが、卒論生が全員そのまま大学院に進学したので、平成27年度は、これら十分に教育できた大学院生3名（M2;1名、M1;2名）に加え、新たに卒論生1名を加えることになり、マンパワーの増強ができたと考えている。
そこで、大学院生1名（M1）には1. のテーマについて、予備的な検討に取りかかってもらっている。3. 及び4. については、大学院生（M2）が平成26年度から検討しており、すでに変異体を取得し、結晶化条件の検討を行っている。また、もう1人のM1は、Fld及びFlrのアポ化条件の検討を行っており、平成26年度からの積み残し課題の解決にあたっている。彼は現在、フラボタンパク質の変性-再生法及びSPR法について、エキスパートとなっている。2. については、学部学生に担当してもらう予定である。
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