澱粉を環状イソマルトオリゴ糖に転換する酵素系の生産・制御機構解明

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26450133
• Research Institution: National Agriculture and Food Research Organization
• Principal Investigator: 舟根 和美 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構, 食品総合研究所応用微生物研究領域, 上席研究員 (90353953)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 環状イソマルトオリゴ糖 / 環状イソマルトオリゴ糖グルカノトランスフェラーゼ / αグルコシダーゼ / 不均化酵素 / GH family 31

Outline of Annual Research Achievements

環状イソマルトオリゴ糖(CI)生産菌であるPaenibacillus sp. 598K 株は、デキストラングルカナーゼ(DGase)と環状イソマルトオリゴ糖グルカノトランスフェラーゼ(CITase)の作用で澱粉を基質としてCIを生産する。DGaseはα-1,4、α-1,3、α-1,2-グルコシド結合を分解、転移する不均化酵素であり、α-1,1-グルコシド結合には作用しないことが明らかになった。マルトテトラオースを基質としたDGase反応生成物を高速液体クロマトグラフィーで分取精製し、NMR分析及び質量分析を行った結果、5糖から成る生成物にα-1,6グルコシド結合が新たに生成していることが明らかになった。DGase は糖質加水分解ファミリー31(GH31)に属し、２つのアスパラギン酸が触媒残基であること、および３つの糖結合モジュールが存在することが推定できた。糖結合モジュールを欠失させると活性を消失した。他のCI生産菌Bacillus circulans T-3040 株についてもDGase 遺伝子をクローニングしたが、可溶性タンパクとして発現されなかった。
598K 株およびT-3040 株のCITase およびDGase 周辺遺伝子を解析した結果、598K 株はCITase遺伝子のすぐ下流にDGase遺伝子が存在したが、T-3040 株のDGase遺伝子についてはCITase遺伝子近傍であったが逆向きに存在した。いずれの菌株もAraCファミリー転写制御因子、ABCトランスポーター、マルトース・パーミアーゼ、ラクトース・パーミアーゼ、マルトース結合タンパクと推定される遺伝子がCITase遺伝子近傍に存在している点が共通していた。T-3040株のcit遺伝子上流のAraC/XylSファミリー転写調節因子ホモログ遺伝子を大腸菌中で発現したが、不溶化し、活性も確認できなかった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

平成26年度に計画していた1) DGase の特性解明、2) CITase およびDGase 周辺遺伝子の解析についてはほぼ計画通り達成することが出来た。3) CITase およびDGase 遺伝子の転写調節因子についてはAraCファミリー転写制御因子と推定される遺伝子を見出し、発現することはできたが、DNA結合活性は検出できなかった。

Strategy for Future Research Activity

27年度は、当初の計画通り、B. circulans T-3040株、Paenibacillus sp. 598K株について各種炭素源によるCITase、DGase 誘導の有無を測定する。26年度に明らかにした2菌株におけるCITase、DGase周辺遺伝子については、特に注目される関連酵素遺伝子が見出せなかったため、当初予定のmRNA量の変化の測定ではなく、CITaseおよびDGaseの誘導と同調して生産誘導されるタンパクを、二次元電気泳動することによって検出を試みることとする。同時にさらに広範囲のDNA塩基配列も明らかにしていく。
28年度は、27年度の結果を元に、CITase、DGaseの発現に関連の深いタンパク・酵素を同定し、それらについて諸性質を調べる。
27年度、28年度に抗生物質耐性菌取得によるリボソーム工学的手法でCI高生産変異株の取得を試み、CITase、DGase、および関連酵素の生産誘導機構および変異による生産誘導の変化について解析する。

Causes of Carryover

消耗品の予定価格と納入価格の差や、人件費において当初の出勤予定と実際の勤務日とに差が生じて差額が出た。

Expenditure Plan for Carryover Budget

当初よりも広範囲にDNA塩基配列を読解する計画となったので、プライマー合成や遺伝子関連試薬の購入の一部に充当する予定である。