2015 Fiscal Year Research-status Report
酵素阻害剤結合ビーズを用いたアシルホモセリンラクトン合成酵素の迅速同定法の開発
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26450140
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| Research Institution | Osaka Prefecture University |
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Principal Investigator |
甲斐 建次 大阪府立大学, 生命環境科学研究科(系), 講師 (40508404)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | クオラムセンシング / AHL合成酵素 / アフィニティービーズ / プルダウン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
前年度に作製したアフィニティービーズでは、微量のAHL合成酵素をプルダウン精製することが困難であった。その理由として、リガンドとビーズの固定化時に生じるトリアゾール環の立体・電子的障害と、リガンド-リンカー部分の疎水性に基づく凝集に原因があることが推察された。そこで、リンカー部位に改変を加えることを計画した。これら２つの課題を解決する最も良い方法として、ポリエチレン（PEG）スペーサーの導入を行った。リンカー部分に、様々な鎖長のPEGスペーサーを導入し、新しいアフィニティービーズを作製した。合成法はこれまでの方法を踏襲し、最後のリンカー導入時にPEGスペーサー入りリンカーを導入した。PEGが高極性であるため、最終反応の収率が大きく低下してしまったが、改良型アフィニティービーズを充分量作製することができた。PEG導入の改良型ビーズと未導入型ビーズの性能を比較したところ、改良型で飛躍的にAHL合成酵素の収量が増加した。その増加量は10倍ほどであり、微量のAHL合成酵素をプルダウンできることが期待された。さらに、特異性の低下などを詳細に調べた結果、いずれの項目においても改良型では性能の向上が認められた。微量のAHL合成酵素のプルダウン精製に向け、細胞ライセート側の条件最適化についての検討も進め始めた。市販のタンパク抽出試薬では、抽出効率は良いものの、結合を阻害している可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
アフィニティービーズの改良が進み、微量のAHL合成酵素をプルダウン精製できるようになったため。
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| Strategy for Future Research Activity |
改良型アフィニティービーズを用いて、様々な細菌よりAHL合成酵素をプルダウンできるかどうかを検討する。また、接合菌内に共生するエンドバクテリアのAHL合成酵素の同定を試みる。
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