Identification of acylhomoserine lactone synthases by affinity beads

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26450140
• Research Institution: Osaka Prefecture University
• Principal Investigator: 甲斐 建次 大阪府立大学, 生命環境科学研究科, 講師 (40508404)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: クオラムセンシング / AHL合成酵素 / プルダウン / アフィニティービーズ

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、グラム陰性細菌のクオラムセンシングシグナル分子であるアシルホモセリンラクトン（AHL)の合成酵素のプルダウン法を確立することを目指いしている。前年度に引き続きアフィニティービーズのAHL合成酵素に対する収量と特異性の向上を中心に進めた。特に今年度はポリエチレングリコール（PEG）スペーサーの長さを変えた効果の検証を行った。PEGを延ばすにつれて、アフィニティービーズの収量と特異性は向上することが分かった。PEGを6つ導入するとほぼ効果が飽和することがことが判明した。さらに磁気ビーズへのリガンド固定化量の最適化を検証するため、ビーズとリガンドのカップリング時のリガンド濃度を細かく振って、固定化量の影響を調べた。リガンド固定化量を減少させた方が、AHL合成酵素の収量と特異性が向上したアフィニティービーズを作成できることが示された。このようにして現在考え得る最適化アフィニティービーズを用いて、AHL合成酵素であるTofIのプルダウンを実行したところ、クルードなタンパク質溶液から極めて微量の酵素のプルダウンに成功した。