2014 Fiscal Year Research-status Report
老化に伴うビタミンC必要性の変化と輸送制御機構の解明に関する研究
| Project/Area Number |
26450163
|
|---|
| Research Institution | Prefectural University of Hiroshima |
|---|
Principal Investigator |
斉藤 靖和 県立広島大学, 生命環境学部, 准教授 (90405514)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
|
| Keywords | ビタミンC輸送 / アスコルビン酸 / 細胞老化 / 活性酸素 / 線維芽細胞 / SASP |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
ビタミンC（VC）は、ヒトでは体内合成できず、その不足は様々な疾患リスクの亢進を招く。これまでに申請者らは、老化に伴ってVCの必要性が増大していることを見出し、高齢者におけるVC摂取の重要性について報告してきた。本研究では、この老化に伴うVC必要性の変化が細胞機能へどのような影響を与えうるのかを明らかにすると共に、VC輸送機構の解明を目的としている。3か年計画の初年度にあたるH26年度には、①VC輸送・蓄積能と老化との関連性、②VC輸送調節因子の2点について検討を行った。まず、ヒト由来の線維芽細胞2種(TIG-1細胞、NB1RGB細胞)について、継代培養を繰り返すことにより細胞を老化させた老化細胞を取得し、老化途中の細胞も含めた凍結細胞ストックづくりを進めた。細胞老化については顕微鏡観察および粒度分析装置による細胞老化に伴う細胞サイズの変化や老化マーカーの一つであるsenescence-associatedβgalactosidase活性の評価により確認を行った。次に、若い細胞および得られた老化細胞を用いて、①VC輸送・蓄積能と老化との関連性について検討を行い、両者のVC輸送能に違いがあることを確認し、これまでの報告を裏付けることを示唆する結果を得た。また、②については亜鉛およびレスベラトロールがVC輸送調節因子となりうる可能性を明らかにした。さらに、老若細胞間の遺伝子発現パターンの差異についてリアルタイムRCRによる解析を行い、ビタミンCトランスポーターであるSVCT1、SVCT2や炎症性サイトカイン等の発現の違いなどについてもデータを蓄積しつつある。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究は、老化がVCの輸送および生理機能に与える影響を明らかにすると共に、VC輸送制御機構を解明することを目的としている。現段階では、H26年度の実験計画として掲げた“老若細胞間でのVC細胞内輸送・蓄積能の差異を明らかにし、VC輸送タンパク質SVCTの発現変化との関連性を明らかにする。また、老化細胞が分泌するサイトカインが周囲の細胞のVC輸送に与える影響を調べる（H26-27年度）”という目標に対して、ヒト由来の線維芽細胞2種(TIG-1細胞、NB1RGB細胞)の老化細胞を取得し、老若細胞間でのVC輸送能の違いについて検証を行うと共に、老若細胞間での発現遺伝子の差異について解析を進めており、老化細胞が分泌するサイトカインが周囲の細胞のVC輸送に与える影響を調べるための予備的な検討データを得ている。また、H27-28年度に計画していた“VC輸送制御機構の解明と調節因子の探索：ストレス刺激に対する応答性の検討やVC輸送活性を高める因子の探索を行う（H27-28年度）”についても予備的な検討を進めている。一方、VC輸送タンパク質SVCT1、SVCT2の発現変化については、ウエスタンブロットによる解析が難航しており、これは、抗体の特異性があまり良くない、あるいは実験条件（抽出、抗体反応条件等）に問題があると考えており、H27年度に最適化を目指して引き続き検討を進めていく方針であり、H27年度中に方法を確立し、タンパク質レベルでのSVCTの発現変化について解析を行う計画である。以上の状況から、当初の実験計画に対して本研究はおおむね順調な進捗状況であると考えている。
|
| Strategy for Future Research Activity |
以下に示す当初の計画に従って、研究を推進していく予定である。
①老若細胞間でのVC細胞内輸送・蓄積能の差異を明らかにし、VC輸送タンパク質SVCTの発現変化との関連性を明らかにする。また、老化細胞が分泌するサイトカインが周囲の細胞のVC輸送に与える影響を調べる（H26-27年度）。
②VCが関連する生理作用との関連性：VCの生理作用として代表的な抗酸化能やコラーゲン合成能とVC輸送・蓄積との関係性を見出す（H27-28年度）。
③VC輸送制御機構の解明と調節因子の探索：ストレス刺激に対する応答性の検討やVC輸送活性を高める因子の探索を行う（H27-28年度）。
研究計画の変更点としては、当初考えていたヒト表皮角化細胞は基本的に幹細胞からの継続的な供給に基づくターンオーバーがあり、細胞老化という観点にそぐわないと考えられることから、当面は線維芽細胞に的を絞って解析を進めていく計画である。また、課題として、達成度の項目でも挙げたように、現在、VC輸送タンパク質SVCT1、SVCT2の発現変化においてウエスタンブロットによる解析が難航しているという問題を抱えているが、この対応として、より高い特異性を有するSVCT抗体を得るため、SVCTのアミノ酸配列より探索したエピトープ配列を抗原として用いた新しい抗体を取得したので、その抗体(抗hSVCT1、hSVCT2抗体)を用いて今後、再検討を進めていく計画である。
|
| Causes of Carryover |
主な理由として、ヒト表皮角化細胞での検討条件を見直したことにより次年度使用額が生じた。
|
| Expenditure Plan for Carryover Budget |
生じた次年度使用額については、老若細胞間での発現遺伝子解析やVCの生理機能の影響などの解析に使用することで生じた予算を研究目的を達成するために有効に活用する計画である。
|
