2014 Fiscal Year Research-status Report
海の牧草スケレトネマの簡便で定量的な同定方法開発とそれを用いた生理生態特性の解明
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26450248
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| Research Institution | Fukuoka Women's University |
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Principal Investigator |
山田 真知子 福岡女子大学, 文理学部, 教授 (30438303)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
片野 俊也 東京海洋大学, 海洋科学技術研究科, 准教授 (00509820)
大坪 繭子 福岡女子大学, 文理学部, 助手 (70336965)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | Skeletonema属各種 / 定量的・簡便･安価な同定法 / マルチプレックスPCR法 / リアルタイムPCR法 / FISH法 / プライマー/プローブ / アニーリング温度 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
コスモポリタンのSkeletonema costatumは、「海の牧草」として漁業生産を支える極めて重要な植物プランクトンである。しかし、2005・2007年に、Sarno et al.によってDNAを用いた系統発生解析と電顕を用いた微細形態解析により、本種は8種に細分化され、Skeletonema属には11種存在していることが報告された。これにより、新規同定基準に基づく種について、多くの研究の追試が必要となった。しかし、この同定法は定量的でなく同定に長期間を要し、高価な上、操作も煩雑で、とくに水産等現場の技術者などが日常的に用いることは容易ではない。そこで、これらの短所を改善した同定法の開発を試みることとした。そのような同定法には定量性の異なるマルチプレックスPCR法、リアルタイムPCR法およびFISH法の3方法が考えられる。これらの中で最も定量的とされるFISH法は、DNAとして細胞内での存在量が多いrDNAのみを用いる方法であるため、H26年度はSSU rDNAとLSU rDNAを用いて、種特異的なプライマー/プローブの開発と結合部分の増幅量の多いアニーリング温度の決定を試みた。その結果、Skeletonema costatum、 Skeletonema dohrnii、 Skeletonema japonium、Skeletonema pseudocostatum およびSkeletonema tropicumの5種について、それらを決定することができた。さらに、得られた結果に基づき、リアルタイムPCR法でこれらの種のプライマー/プローブを用いて、S. dohrniiの検出を定量的に行えるか検証を試みたところ、本種のみのDNA増幅効率が極めて良好で、DNAの定量も可能であったことから、S. dohrniiについては定量的な同定を行えることが確認された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
定量的かつ簡便なSkeletonema 属各種の同定法を確立するには、前提として、我が国沿岸域に出現するSkeletonema 属全種についての正確な情報の把握が必要である。そこで、H26年度には新同定法の開発に先立ち、これらの情報の入手にも傾注し、【今後の研究の推進方策等】に述べるような成果が得られた。
GenBankに登録されているSkeletonema 属各種のSSU rDNAとLSU rDNAの塩基配列について、今回設計したプライマーとそれに対応するSkeletonema塩基配列の整合性を検討した結果、プライマーの塩基配列が種特異的であるものの、対象種とそれ以外の種との塩基相違数が1～2塩基と少ない場合も存在することも確認された。また、Skeletonema menzeliiなど隠蔽種の存在する種については、遺伝的に異なる種を対象とするため、プライマーの設計が困難であることが確認された。
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| Strategy for Future Research Activity |
正確な情報を得るために、2005・2007年にSarno et al.によって提案された11種を基に検討を加えると、次のことが確認された。S. dohrniiとSkeletonema marinoiは同一種であること、我が国にはSarno et al.（2005・2007）が報告しなかったSkeletonema potamos（淡水産種）や未命名の1種が汽水域や海域に出現すること、S. menzeliiとS. tropicumの2種は世界に隠蔽種が存在するので我が国沿岸域に出現する株のみが対象にされなければならないこと、またSkeletonema grethaeは出現域が北アメリカ沿岸域に限定される（Kooistra et al. 2008）ので今回の対象種からは除外すること、などである。そこで、結局、淡水産種や汽水産種を加えたSkeletonema 属11種を対象とする開発が必要であることが確認された。H26年度に行った研究により、FISH法のrDNA では、全塩基配列の中で既知の部分については対象全種について定量・簡便同定法の開発が困難であることが確認されたので、今後は塩基数が4,000～5,000ほど存在するrDNAの未読の部分について解読を行い種特異的なプライマー/プローブの開発と塩基配列の増幅量の多いアニーリング温度の決定を試みる計画である。また、rDNAはpolymorphismをとり種の同定を困難とさせる場合があるので、シングルコピーであるmtDNA cox1を用いてリアルタイムPCR法の開発も試みていく計画である。
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| Causes of Carryover |
実験の成果を得るためには、実験生物（Skeletonema）の持続的な培養は、必要不可欠な事柄である。しかし、現在、当研究室で実験生物の培養のために使用しているインキュベータは、温度設定の不安定などが生じて故障の危機にさらされている。そこで、このような器機の修理や買い替えに備え、次年度に繰越を行なった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
数台のインキュベータが温度のみでなく照明不安定の症状も示している。耐用年数を越える器機を使用しているため致し方のないことであるかもしれないが、故障原因を明確にし、要する費用を抑えながらも実験に支障をきたすことのない様、対処していきたい。
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