Developmental study of marine virus monitoring method in natural sea area.

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26450249
• Research Institution: The Nippon Dental University
• Principal Investigator: 豊田 健介 日本歯科大学, 生命歯学部, 非常勤講師 (40585874)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 海洋ウイルス / 定量検出 / ELISA法 / Real-time qPCR / 藻類 / 珪藻

Outline of Annual Research Achievements

これまでの海洋ウイルスの自然水域における動態の調査法ではウイルス検出限界値も低い上，一度に大量のサンプルを測定することが困難であった。そこで，予備実験により得られた赤潮の因子として知られるキリンドロテカ・クロステリウム（真核単細胞藻類珪藻）を宿主とする3タイプの新種ウイルスをモデルとし，より高感度で安定的な自然海域におけるモニタリング法の開発を目的に，研究計画に基づき，主に次の4項について実験を行った。1) 宿主リアルタイム定量PCR，2) 3新種のウイルスの性状解析，3) ウイルスのリアルタイム定量RT-PCRの開発，4) ELISA法によるウイルス定量法の開発。
宿主リアルタイム定量PCRについて，rDNA ITS1領域に特異性の高い領域を確認し，Syber Green法による定量解析法を確立した。3種のウイルスの性状解析について，8k～11kbの+センスssRNAであることが確認され，それらの塩基配列の相同性は50%以上であり，中でもRNA依存RNAポリメラーゼ発現配列を用いた系統解析では，他の珪藻感染性RNAウイルスと同系統であることが確認された。これらの塩基配列のデータを用いて行ったリアルタイム定量RT-PCR法の開発においては，TaqMan Probe法ではなく，より安価なSyber Green法による検出・定量法が確立された。さらに，ウイルスカプシドタンパクをコードする領域の配列より，ポリクローナル抗体を作製し，ELISA法（競合法）による，ウイルス検出定量法の開発も行った。結果，本研究機関2年度目に開発されたリアルタイム定量RT-PCR法を用いた手法よりも，さらに高感度にウイルスを検出することが可能となった。開発された検出定量手法を自然海水を用いて検証を行ったところ，宿主細胞が検出されない時期においても沿岸砂泥（水深30cm程度）からウイルス（KT12RNAV）がわずかに検出されることが明らかになった。