2014 Fiscal Year Research-status Report
尿素輸送体アイソフォームの機能特性からスサビノリ窒素代謝の分子機構を探る
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26450283
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| Research Institution | Mie University |
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Principal Investigator |
柿沼 誠 三重大学, 生物資源学研究科, 准教授 (60303757)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 紅藻 / スサビノリ / 尿素 / 輸送体 / 窒素代謝 / DUR3遺伝子 / 色落ち / 施肥 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年のノリ養殖場の栄養塩類不足により，スサビノリ葉状体の色落ちが頻発している．スサビノリ葉状体は無機態窒素と同様に尿素をよく代謝し，色落ち葉状体の生理状態回復に尿素の施肥が有効であることが明らかにされている．これまでに，スサビノリの尿素代謝に関わる3種類の尿素輸送体遺伝子（PyDUR3.1/3.2/3.3遺伝子）が単離・同定されているが，各PyDUR3遺伝子の発現特性や各PyDUR3アイソフォームの細胞内機能の詳細は未だ不明である．そこで本年度は，各PyDUR3遺伝子の発現特性と細胞内動態を明らかにすることを目的として以下の研究を行った．
1．スサビノリ葉状体および糸状体におけるPyDUR3遺伝子の発現特性解析
異なる栄養環境（通常または貧栄養環境）で培養した葉状体および糸状体から抽出・精製した全RNAを用いてcDNAを調製した．このcDNAを鋳型としたリアルタイムPCR（内部標準18S rRNA，検量線法）により，PyDUR3.1/3.2/3.3遺伝子発現の相対定量解析を行った．その結果，各PyDUR3遺伝子の発現は葉状体や糸状体といった世代間や栄養環境で大きく変化し，転写レベルで調節されていることが明らかとなった．
2．PyDUR3アイソフォームの細胞内動態解析
酵母，陸上植物，スサビノリ葉状体内で構成的に発現する遺伝子のプロモーター下流に，PyDUR3.1/3.2/3.3遺伝子および緑色蛍光タンパク質（GFP）遺伝子cDNAを挿入してGFP融合PyDUR3発現ベクターを構築した．発現ベクターを酵母，タマネギ表皮細胞，スサビノリ葉状体に導入後，GFP蛍光を指標として各PyDUR3の細胞内動態を調べた．いずれの発現系においてもPyDUR3の細胞膜への局在が認められたことから，各PyDUR3は尿素の取込みに重要な役割を果たす細胞膜局在型輸送体であると考えられた．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では，スサビノリの窒素代謝や貧栄養環境下における生存戦略に重要な役割を果たしていると考えられる3種類の尿素輸送体遺伝子（PyDUR3.1/3.2/3.3遺伝子）の転写調節機構，各PyDUR3アイソフォームの細胞内機能特性とスサビノリ窒素代謝の分子メカニズムとの関わりを明らかにすることを目的としている．
本年度の研究実施計画には，（1）スサビノリ葉状体および糸状体におけるPyDUR3遺伝子の発現特性解析，（2）遺伝子導入・発現系を利用したPyDUR3アイソフォームの細胞内動態解析，をあげていた．（1）についてはほぼ計画通りに研究が進み，各PyDUR3遺伝子の世代（葉状体と糸状体）特異的あるいは栄養環境（通常環境と貧栄養環境）特異的な発現性を明らかにすることができた．しかしながら，貧栄養環境下で培養して色落ち誘導したスサビノリ葉状体や糸状体に対する無機態窒素や有機態窒素の施肥が，各PyDUR3遺伝子発現に及ぼす影響を明らかにするには至らなかった．（2）についても計画通りに研究が進み，各PyDUR3アイソフォームはスサビノリ葉状体細胞内において細胞膜に局在化していること，次年度以降の研究にも今回の遺伝子導入・発現系が利用できることが明らかとなった．
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度の研究実施計画（1）スサビノリ葉状体および糸状体におけるPyDUR3遺伝子の発現特性解析のうち，未着手となっている一部条件下での発現特性解析を行う．
次年度の研究実施計画（3）酵母発現系を利用したPyDUR3アイソフォームの細胞内機能解析については，今年度の研究において有効性が確認された酵母発現系を利用して，当初の計画通りに進める．また，研究実施計画（4）PyDUR3遺伝子上流領域の塩基配列解析による転写調節機構の解明についても当初の計画通りに進め，各PyDUR3遺伝子の上流領域をコードするgDNAクローンの単離とその塩基配列解析により，各PyDUR3遺伝子の発現特性の差異に関わるプロモーター領域や転写因子結合領域等のシスエレメントを同定する．
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| Causes of Carryover |
本年度の研究実施計画（1）スサビノリ葉状体および糸状体におけるPyDUR3遺伝子の発現特性解析のうち，一部条件下での発現特性解析を行うことができなかったため，リアルタイムPCR関連試薬の購入に必要としていた消耗品費に残額が生じた．
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
今年度の研究実施計画（1）スサビノリ葉状体および糸状体におけるPyDUR3遺伝子の発現特性解析のうち，未着手となっている遺伝子発現特性解析に，次年度直接経費の約10％を使用する．
次年度の研究実施計画（3）酵母発現系を利用したPyDUR3アイソフォームの細胞内機能解析と，（4）PyDUR3遺伝子上流領域の塩基配列解析による転写調節機構の解明，に必要な消耗品の購入等に次年度直接経費の約40％を使用する．また，次年度直接経費の約40％を塩基配列解析に必要なDNAシーケンサー（学内共同研究機器）の利用費等に，次年度直接経費の約10％を学会発表等の旅費に使用する．
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