2014 Fiscal Year Research-status Report
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26450284
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| Research Institution | The University of Tokushima |
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Principal Investigator |
辻 明彦 徳島大学, ソシオテクノサイエンス研究部, 教授 (20155360)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | バイオマス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
でんぷん分解に関与するアメフラシ消化液に存在する酵素として、２種類の59 kDa, 80 kDa α-アミラーゼ (Amy)、２種類の74 kDa, 86 kDa α-グルコシダーゼ(AGL)を精製し、でんぷん、マルトヘプタオース、グリコーゲン、デキストラン等の基質に対する作用機作について解析し、59kDa, 80kDaアミラーゼの主要プロダクトは、それぞれマルトトリオース、マルトースであり、一方74kDaのα-グルコシダーゼに比べ、80kDaのα-グルコシダーゼは、α-1,6結合を含むアミロペクチンをよく切断することを明らかにした。
さらに、でんぷん分解に関与する４種類の酵素およびセルロース分解に関与する95, 65, 45, 21kDa β-1,4-エンドグルカナーゼ(EG)、210, 110kDa β-グルコシダーゼ(BGL)の内部アミノ酸配列からプライマーを設計し、アメフラシ肝膵臓cDNAよりPCRクローニングを行い、大量発現系構築の準備を進めた。さらに、アラメの消化を促進する25kDaの蛋白質を同定し、その作用機構について解析した。また、アルギン酸ビーズを用いて固定化したBGLの有用性を証明した。以上の成果のうち、アメフラシのでんぷん分解系システムについては、FEBS Open Bio (2014) 560-570に発表した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
大量発現系構築のため、分解酵素の内部アミノ酸配列からプライマーを設計し、アメフラシ肝膵臓cDNAを鋳型としたPCR法によってセルロース、でんぷん分解酵素のクローニングを進めた。これまでに45kDa, 21kDa EG, 110kDa BGL, 74kDa AGL, 59kDa Amyは全長cDNAを得た。95, 65kDa EG, 80kDa Amy, 86kDa AGLについては5'-RACEによって完全長cDNAのクローニングを行っており、近いうちに210kDa BGLを除いて、9種類のグリコシダーゼの酵母を用いた発現系の研究を開始できる準備が整った。さらに、アラメに多く含まれるラミナランはBGLによって加水分解され、効率よくグルコースが産生されるが、アラメとBGLを反応してもグルコースは産生されない。そのため、アメフラシ消化液中にBGLによるアラメ分解を促進する蛋白質がないか検索したところ、25kDaのBGL分解促進蛋白質を同定し、この25 kDaの蛋白質のクローニングも開始した。
また、アルギン酸ビーズで固定化することによって、BGLやAGLはセルロースやでんぷんの分解産物からのグルコース産生反応に複数回（10回程度）使用可能で、酵素コストを減らすことができることを示した。
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| Strategy for Future Research Activity |
既にクローニングを終了、または進行中のセルロースとラミナラン分解系、およびでんぷん分解系を構成する消化酵素の酵母による大量発現を構築し、海藻の種類に応じた酵素糖化システムの確立をめざす。特に、資源量が多く、でんぷん含量が高いアオサや、ラミナラン含量が高く、グルコース産生量が海藻に中で最も高いアラメの糖化に至適化した酵素カクテルを作成する。
海藻にはアミラーゼ、AGL, BGL等の消化酵素に対して強力な阻害作用を有する物質が含まれ、海藻の酵素糖化の障害になっている。特に褐藻類のアラメやヒバマタにはBGL阻害物質が含まれ、ラミナランやセルロースの酵素糖化を抑制する。阻害物質を含有しない海藻を大量処理する場合、混入した別の海藻に含まれる阻害物質によって、海藻の酵素糖化が著しく抑制される可能性が高く、商業レベルの海藻の酵素分解を行うには、この阻害物質の問題を解決することが必須である。今回、BGLによる分解を促進する蛋白質として同定された25kDa蛋白質は、アラメに含まれる阻害物質の作用を抑制する。海藻や微細藻類を主食とする動物には、海藻中の消化酵素阻害物質の作用を回避するシステムを有すると考えられ、このような蛋白質を利用することが重要と考えられる。今回、同定した25kDa蛋白質の作用機構の解明と利用について研究を推進する。
褐藻類に含まれるフコイダン等の特殊な構造を有する多糖類の分解系についても、褐藻類を摂食する貝類の消化液を用いて、研究を進める。
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| Causes of Carryover |
当該年度において、626円で購入可能な物品がなかったため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度予算と合算して、試薬の購入に使用する予定である。
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[Journal Article] Comprehensive enzymatic analysis of the amylolytic system in the digestive fluid of the sea hare, Aplysia kurodai: Unique properties of two α-amylases and two α-glucosidases.2014
Author(s)
Tsuji, A., Nishiyama, N, Ohshima, M., Maniwa, S., Kuwamura, S., Shiraishi, M. and Yuasa, K.
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Journal Title
FEBS Open Bio
Volume: 4
Pages: 560-570
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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