2015 Fiscal Year Research-status Report
魚類の細胞内LPSセンサーの探査およびその認識機構の解明
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26450288
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| Research Institution | University of Miyazaki |
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Principal Investigator |
引間 順一 宮崎大学, 農学部, 准教授 (70708130)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | インフラマソーム / NLRファミリー遺伝子 / 炎症反応 / 炎症性サイトカイン遺伝子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
魚類ではLPS刺激に対して炎症反応や貪食活性等の免疫応答があるにも関わらず、TLR4を介したLPS認識機構が欠損しているばかりか、細胞内のLPS認識機構も不明である。そこで申請者は、未だ不明な細胞内LPS認識機構に、魚類のLPS認識を担う受容体（センサー）が存在しているのではないかと考えた。本研究事業では、魚類における初めての細胞内LPS認識センサーの発見を目的として、魚類細胞内における細胞内寄生性細菌LPS認識機構に関与するインフラマソーム関連遺伝子の同定およびその認識機構を解明することを計画している。H26年度に引き続き、平成27年度はトラフグのインフラマソーム関連遺伝子の内まだクローン化が完了していなかったNLR-C10およびNLR-C12遺伝子の全塩基配列を決定することに成功した。その結果、哺乳類のものとは異なり、典型的なPYDドメインを持たないことが分かった。さらに、様々な株由来のLPSにより強く遺伝子発現が誘導されることを確認した。さらに、シリカ結晶分子などを用いてトラフグ頭腎細胞を刺激後、NLR-C12遺伝子などのインフラマソーム関連遺伝子が誘導するかについて検討した。この実験は当初の計画と異なるが、結晶分子が炎症を引き起こすことが未解明のままであり、本研究事業にはシリカ結晶およびアラム（水酸化アルミニウム）によるインフラマソームの活性化機構の解明が重要であると考えた。そこで、シリカ結晶およびアラム（水酸化アルミニウム）を用いてトラフグ頭腎細胞を刺激したところ、頭腎細胞の貪食活性は有意に上昇し、炎症性サイトカインであるIL-1β遺伝子の発現が上昇することが分かり、インフラマソームによる炎症反応が誘導されたと考えられた。また、NLR-C12遺伝子が特に強く誘導されることが明らかとなったことから、NLR-C12はインフラマソームを形成している可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成27年度は、(1)トラフグのインフラマソーム関連遺伝子、NLR-C10およびNLR-C12遺伝子のクローン化と、(2)シリカ結晶分子などを用いたトラフグ頭腎細胞刺激後のインフラマソーム関連遺伝子の誘導について検討した。(2)の実験は当初の計画と異なるが、結晶分子が炎症を引き起こすことが未解明のままであったことと、インフラマソームの機能解明のためにはシリカ結晶およびアラム（水酸化アルミニウム）を用いた刺激実験が重要であると考えた。
まず１つ目の(1)の実験について、トラフグのNLR-C10およびNLR-C12遺伝子の前塩基配列をクローン化することに成功した。その結果、哺乳類のものとは異なり、典型的なPYDドメインを持たないことが分かった。さらに、様々な株由来のLPSにより強く遺伝子発現が誘導されることを確認した。
次に(2)の実験は、シリカ結晶およびアラム（水酸化アルミニウム）を用いてトラフグ頭腎細胞を刺激することにより、頭腎細胞の貪食活性は有意に上昇し、炎症性サイトカインであるIL-1β遺伝子の発現が上昇することが分かり、インフラマソームによる炎症反応が誘導されたと考えられた。また、NLR-C12遺伝子が特に強く誘導されることが明らかとなったことから、NLR-C12はインフラマソームを形成している可能性が示唆された。
今後、魚類のインフラマソームが実際に炎症誘導に係っているかを下記らかにするために、インフラマソーム関連遺伝子の過剰発現系を構築し、機能解明を行う予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成２８年度の研究の推進方策としては以下の通りである。
(1) LPS認識に関与するセンサー遺伝子のIL-1βの活性化
同定したASCおよびNLR-C12遺伝子を発現ベクターにクローン化し、魚類の培養細胞（HINAEあるいはEPC細胞等）を用いて、IL-1βを活性化させるかを確認するための一過性の実験系を行う。また、この実験系がうまく機能しなかった時のバックアッププランとして、トラフグに直接注射してDNAワクチンの手法で実験できるかを検討する。この際に、Edwardsiella tardaを感染させたときの増殖抑制についても検討する
(2) LPS認識センサー遺伝子によるNF-κBの活性化
申請者のこれまでの研究成果から、フグの腎臓細胞ではLPS、ナイジェリシン、シリカ結晶およびアラムの刺激によって炎症性サイトカイン遺伝子の発現が強く誘導されることから、これらの誘導にインフラマソームが関与していると考えられる。さらにIL-1βの活性化に伴い、炎症性サイトカイン遺伝子の発現を制御しているNF-κBの活性も増強されると推測できる。そのため、インフラマソームによるLPS認識を介したNF-κB活性についてもレポターアッセイにより解析する。
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[Presentation] METAGENOMIC ANALYSES OF BACTERIAL FLORA IN THE POND WATER AND INTESTINE OF TILAPIA IN THAILAND2015
Author(s)
T. Aoki, U. Watanabe, H. Takeyama, W. Suda, S. Hattori, J. Hikima, M. Sakai, S. Unajak, M. Rapeepat, HC Wang, CF Lo
Organizer
17th International Conference on Diseases of Fish and Shellfish (EAFP conference)
Place of Presentation
Las Palmas de Grand Canaria, Spain
Year and Date
2015-09-07 – 2015-09-11
Int'l Joint Research
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