2015 Fiscal Year Research-status Report

ヒスタミン生成遺伝子の伝播を拒絶する水産食品発酵用乳酸菌スターター株の開発

Research Project

Project/Area Number	26450299
Research Institution	Japan Fisheries Research and Education Agency
Principal Investigator	里見正隆国立研究開発法人水産総合研究センター, 中央水産研究所, 研究員 (00344325)
Project Period (FY)	2014-04-01 – 2017-03-31
Keywords	好塩性乳酸菌 / プラスミド / 不和合性 / ヒスタミン / 発酵スターター
Outline of Annual Research Achievements	醤油や魚醤油など発酵調味料の製造過程では、アレルギー様食中毒の原因物質であるヒスタミンの蓄積が問題となる。ヒスタミンの蓄積は発酵調味料製造用発酵スターター（発酵の種株）と同じ種類の好塩性乳酸菌によるものであり、ヒスタミン生成酵素遺伝子(hdc)は本菌種が持つプラスミド（pHDC-A型）にコードされている。そのため、オリジナルのスターター株にhdc を持つプラスミドが伝播して、新たなヒスタミン生成菌が生み出される危険性がある。本研究では、プラスミドの不和合性（細菌細胞内で同じ複製開始点を持つ複数のプラスミドは共存し得ないという性質）に着目し、発酵スターター株にあらかじめhdcをコードしていないpHDC-A型の複製開始点を持つプラスミドを保有させ、外来のhdcをコードするプラスミドの取り込みを拒絶する安心安全な発酵スターター株を構築することを最終目標とする。本年度は、好塩性乳酸菌のプラスミドの除去および導入技術の開発に関する研究を行った。平成26年度に得られたpHDC-A型の複製開始点を持ち、hdcをコードしているプラスミドを保有している菌株からのプラスミド脱落実験を行った結果、pH5.0以下の環境に曝すとプラスミドが脱落することを明らかにした。現在、脱落に要する時間、詳細なpH条件を検討している。また、菌株間のプラスミドのやり取り（プラスミド伝達能）を明らかにするため、pHDC-A型のプラスミドを保有する株としない株を識別するための選択培養法を検討している。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 遺伝子導入の成否を判定するための手法が新規であるため、慎重に進めている。特にプラスミドを保有している株と保有していない株を培地上で効率よく識別する手法の開発に時間がかかっている。両者の識別には抗生物質耐性の差が利用できることが明らかとなり、現在、選択培地の開発に取り組んでいる。
Strategy for Future Research Activity	平成26年度に分離したヒスタミンを生成しないpHDC-A型プラスミドを保有する菌株のヒスタミン生成遺伝子の拒絶能を評価する。プラスミドのpHDC-A型の複製開始点を持ちhdcをコードしていないプラスミドを保有している菌株（ヒスタミン非生成株）をおよそ300株分離することに成功しているため、これらの菌株から、pHDC-A型の複製開始点を持ちhdcをコードしているプラスミドを保有している菌株（ヒスタミン生成菌）と異なる抗生物質耐性を持つ菌株を選抜する。ヒスタミン生成株と非生成株両者を混合培養し、前述した抗生物質耐性の違いを利用して両者を識別し、ヒスタミン非生成株が生成株に変質した割合を算出する。プラスミドを全く持っていないヒスタミン非生成株を陰性対照とし、プラスミド伝播率を評価する。上記の実験により、pHDC-A型の複製開始点を持ちhdcをコードしていないプラスミドを保有していることでヒスタミン生成菌に変質しにくくなっていることが確認できたら、実際の製造現場で発酵スターター株として試作品製造実験に使用する。
Causes of Carryover	遺伝子導入、細菌培養に関連する試薬・消耗品が必要となる。また、候補となるプラスミドの構造を解析し、より有用なプラスミドを選抜するため、プラスミドの塩基配列決定およびそれに関連する試薬・消耗品が必要である。上記の研究を遂行するため、研究補助職員を1 名、3カ月程度雇用し、研究を推進する予定である。
Expenditure Plan for Carryover Budget	DNA解析試薬：10万円×2箱＝20万円、PCR試薬：5万円×2箱＝10万円、培地：2万円×2個＝4万円、プラスチック消耗品：2万円×5箱＝10万円、賃金：17万円×3か月＝51万円