水から抽出したDNAを用いて水路に生息する魚類を検出する手法の開発

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26450348
• Research Institution: National Agriculture and Food Research Organization
• Principal Investigator: 小出水 規行 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 農村工学研究部門水利工学研究領域, 上級研究員 (60301222)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 環境DNA / 農業水路 / 水田生態系

Outline of Annual Research Achievements

当研究課題では，農業水路の水に含まれているDNA（以下，環境DNA）を抽出し，水田水域の代表魚種であるドジョウ（Misgurnus anguillicaudatus）とタモロコ（Gnathopogon elongatus）のDNAが存在するかどうか検出し，その有無に基づいて両種の生息状況を評価する手法を開発する．
平成27年度は，Polymerase Chain Reaction（以下，PCR）増幅により，環境DNA中に含まれているドジョウとタモロコのDNAを検出する手法の開発に取り組んだ．まず，PCR増幅に必要な両種の種特異的なプライマー（約20塩基の人工DNA）について設計した．ミトコンドリアDNAのシトクロームb遺伝子配列等を対象にDNAデーターベースに登録されている塩基配列及びこれまで蓄積した両種の塩基配列を利用して，約100～400塩基を増幅できるようにデザインした．設計したプライマーのPCR反応条件として，PCR後に生成された増幅産物を電気泳動し，泳動画像上のDNAバンドから増幅力の高い反応温度とサイクル数を決定した．次に，両種の生息を確認している現地水路の水を用いてプライマーの検証実験を行った．昨年度（平成26年度）に取り組んだ環境DNAの抽出法を利用して，採水した水1L程度をグラスフィルターでろ過し，そのフィルター上の残渣からカラムキットを用いて環境DNAを抽出した．PCR反応後の結果として，ドジョウとタモロコともに明瞭なDNAバンドが電気泳動画像上に出現し，当プライマーを用いて環境DNAから両種のDNAを検出できることを確認した．

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

平成27年度の当初計画は，PCR増幅により環境DNA中に含まれているドジョウとタモロコのDNAを検出する手法について取り組むことである．研究実績の概要に記したように，その内容は計画がおおむね順調に進展していることを表している．

Strategy for Future Research Activity

平成28年度は，本手法の有効性を確認するため，現地の水路系に配慮した環境DNA分析を行う．

Causes of Carryover

次年度使用額は，プライマー検証等のPCR実験が順調に進み，研究費を効率的に使用して発生した残額である．

Expenditure Plan for Carryover Budget

次年度に計画している農業水路系における環境DNA分析に必要な試薬購入に使用する予定である．