2014 Fiscal Year Research-status Report
時期特異的なADAM17基質特異性制御の解明による卵成熟誘導因子の探索
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26450381
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| Research Institution | Prefectural University of Hiroshima |
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Principal Investigator |
山下 泰尚 県立広島大学, 生命環境学部, 准教授 (50452545)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
島田 昌之 広島大学, 生物圏科学研究科, 准教授 (20314742)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 卵胞発育 / ADAM17 / ANNEXIN / 卵成熟 / 体外成熟培養法 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ブタやウシなどの産業動物において、体外成熟培養（IVM）法を適用することにより優良形質個体の卵巣に数多くある卵を用いて多くの産子を得ることが可能となるが、胚盤胞率はブタでは20%程度と低い。この原因には発達段階の卵胞から未成熟卵を排卵時のFSH濃度で培養し、成熟卵を得ることに一因があると考えられている。これまでに排卵刺激後の卵胞ではEGF-like factorがその切断酵素であるADAM17により切出され、卵丘細胞の膨潤やMII卵が認められることを示してきた。しかし、ADAM17は排卵刺激後に一時的に発現量が増加するが、増加量は小さいことから卵胞発育時にも存在すると考えられる。近年、ADAM17は他細胞種においてANNEXINと結合し基質選択性が変化することが報告された。H26年度において、卵胞発育時のブタ卵胞において、ADAM17とANNEXIN（Anxa2、Anxa8、Anxa9）の発現を解析したところ、どの卵胞サイズにおいてもこれらの発現が認められることを明らかにした。また、ANNEXINにより制御されるADAM17の活性においてもこの卵胞サイズで活性上昇することを認めた。さらにANNEXINとADAM17が結合することで切断されることが報告されているHB-EGFとTGF-αの発現を調べたところ、Hb-egfおよびTgfa のmRNA発現が認められた。このことから、卵胞発育時にANNEXINとADAM17は、基質選択性によりHB-EGFをTGF-αを切断し、卵胞発育を誘導する可能性が示唆された。現在、ANNEXINのどのタイプがADAM17と結合しているのかを、それぞれADAM17阻害剤と抗ADAM17抗体を用いた免疫沈降により検出し、切断時期と結合性を調べているところである。また、ADAM17阻害剤を無添加あるいは添加して培養したサンプルのプロテオーム解析によりHB-EGF、TGF-αを含めた新規の卵胞発育促進候補因子の存在について探索しているところである。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
H26年度の研究実績により、卵胞発育時の顆粒膜細胞において、ADAM17に加え、その制御に関与するANNEXIN2、ANNEXIN8、ANNEXIN9が同調して発現していること、その切断基質候補のHB-EGFおよびTGF-aの発現が認められた。このことから、H26年度から現在において、ANNEXINのどのタイプがADAM17と結合しているのかを調べ、切断時期と結合性を調べている。また、ADAM17阻害剤を無添加あるいは添加して培養したサンプルのプロテオーム解析によりHB-EGF、TGF-αを含めた新規の卵胞発育促進候補因子の存在について探索している。二次元電気泳動後のゲルのスポット解析の結果、ADAM17阻害剤無添加とADAM17阻害剤添加区では、ADAM17阻害剤添加区で検出されないスポットが数カ所認められ、現在そのMALDI/TOFMASによる質量解析を行っているところである。このことから、当初計画と達成も概ね計画通り進展していると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究課題は、H26年度の研究実績を受けて、次年度は主に4つのプロジェクトで研究を展開する予定である。すなわち、①ADAM17と結合し、選択性を与えるANNEXINの特定、②ADAM17とANNEXINの結合により特異的に切断される切断基質の特定。③切断基質の切断時期の特定、である。現在これらの研究については解析中であり、H27年度に明らかにするという年次計画通りに概ね進展している。この研究により、これまで卵胞発育時に全く注目されていなかったADAM17と結合するANNEXIN類の卵胞発育に果たす役割に関する成果を得ることが可能となり、学術的に高い成果を得ることができると考えられる。この研究成果により、H28年度に計画している④IVM時における切断基質の役割に関する解析、⑤ADAM17とANNEXINによる切断される因子を時間、空間的に添加した新規IVM法の開発、に繋がると考えられる。これらの切断基質を添加する新規IVM法は、動物を屠殺することなく卵巣内のサンプルを入手することのできるOPUや希少動物の優勢卵胞の選別に利用できる可能性があると考えられる。また、ウシやブタなどの産業動物において、これまで高確率に成熟することのできなかった発育段階の卵胞を、高確率に成熟させることができるようになると期待される。H27年度は、上記研究を獣医畜産分野に貢献すべく研究を進めていく予定である。
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| Causes of Carryover |
H28年度にADAM17とANNEXINにより切断される因子を添加したブタIVM法を開発するため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
体外培養に必要な試薬類を20万円、プラスチック製品20万円、体外受精費用5万円、学会発表、論文発表費用を15万円使用する予定である。
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