2015 Fiscal Year Research-status Report
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26450383
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| Research Institution | Rakuno Gakuen University |
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Principal Investigator |
天野 朋子 酪農学園大学, 農食環境学群, 准教授 (60388585)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | Clock / 概日時計 / マウス / 着床 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
時計遺伝子の一つであるClockは多くの遺伝子の転写に関与し、特定のタイミングに起きる現象に関わっている。哺乳類の生殖には、排卵や着床、出産など、特定のタイミングに起こるイベントが多く、時計遺伝子群との関連が想定される。H26年度までの検討では、Clock変異をホモに持つマウスを用いた交配にて、子宮内での着床胚の位置取り(スペーシング)の異常とともに、これに基づく着床数と産仔数の減少を認めた。またスペーシングの良否には、胚のClock変異が関与していることも明らかになった。胚の時計遺伝子と着床との関連はこれまでに報告がなく、胚でのClockの機能解析には高い価値があると判断された。従ってH27年度以降は、着床直前の胚に発現し、着床に必須の生理機能を付与するCox2やHrh2などの発現を、Clock変異を持つ胚と野生型の胚にて比較を行い、これらの遺伝子とClockとの関連を調査することとした。一方、着床直前の交尾後3.5日目に得られるClockホモ胚と野生型胚は、形態的にはともに胞胚腔の認められる胚盤胞期胚である。しかし胚盤胞期胚は50程度の細胞から成り、Clockホモ胚と野生型胚の細胞数の異なりが、遺伝子発現量の差として検出される可能性がある。また、胚盤胞期胚にはICMとTEという2つの細胞群が存在し、両胚でその細胞数の比が異なり、これが遺伝子発現量の差として検出される可能性もある。そこで遺伝子発現の比較に先立つ予備検討として、両胚の細胞数とICM/TEの細胞数比の比較を行った。その結果、両胚の細胞数は同じであったが、ICM/TEの細胞数の比は異なっていた。一方、Clockヘテロ胚の細胞数とICM/TE比は、野生型胚と同様であったことから、野生型胚とClock変異を持つ胚の遺伝子発現をmRNAの量にて比較する際には、Clockヘテロ胚の使用が好ましいことが明らかになった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
H27年度は、Clock変異を持つ胚と野生型胚におけるCox2やHrh2など、着床関連遺伝子の発現の比較に先立ち、予備検討として、Clock変異を持つ胚と野生型胚の細胞数とICM/TE比の比較を行った。この予備検討はH27年度に予定・計画されていたものであり、妥当な進捗と考える。しかし、この予備検討の手技として用いたヘキスト/PI二重染色法において、染色濃度の条件検討に予想外に長い時間を要した。さらにClock変異をホモに持つ胚のICM/TE比が、野生型胚とは予想外に異なっていたこともあり、さらに検討が長引いた。一方で、H26年度に行ったClock変異雌マウスの実際の妊娠・出産の成績のデータはすでにまとめ終え、論文投稿の準備に入っている。
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| Strategy for Future Research Activity |
計画に基づき、Clock変異を持つ胚と野生型胚において、すでに着床との関連が知られるCox2やHrh2など、いくつかの遺伝子について発現を比較する。また、この検討の結果からClockとの関連が疑われる遺伝子については、クロマチン免疫沈降法などにより、その発現へのClockの関与を調査する。
計画では、胚における遺伝子発現の比較は、mRNAの量にて行うこととしていた。しかしH27年度の検討から、Clock変異をホモに持つ胚と野生型胚では、ICM/TE比が異なることが示され、Clock変異をホモに持つ胚と野生型胚における遺伝子発現の比較をmRNA量の比較にて行うと、その細胞種の異なりが結果に反映する可能性が考えられた。従って、Clock変異をホモに持つ胚と野生型胚の遺伝子発現を比較する際は、免疫蛍光染色により、細胞種の明らかな1細胞の染色度の比較を行うなど、代替法での実施を予定している。
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| Causes of Carryover |
計画では、H27年度以降の実験として、胚/子宮における遺伝子発現解析に予算を充てていた。しかし予備検討に時間がかかり、解析がH28年度に持ち越された。また、H27年度に予定していた国際学会への参加を、H28年度に変更した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
H28年度に胚/子宮の遺伝子発現解析を行う。またH28年度7月にISAG(International Society for Animal Genetics, 要旨はすでにアクセプトされている)に参加し、発表を行う。
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