2015 Fiscal Year Research-status Report
マウス中枢神経系への遺伝子導入によるALS新規病態モデルの開発及び応用研究
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26450403
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| Research Institution | Shiga University of Medical Science |
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Principal Investigator |
守村 敏史 滋賀医科大学, 神経難病研究センター, 助教 (20333338)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | ALS / オートファジー / 小胞体ストレス / ユビキチン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
（１）孤発性筋萎縮性側索硬化症(ALS)の細胞質内封入体主要構成蛋白質TAR DNA-binding protein of 43KDa (TDP-43）は、封入体内でユビキチン化、リン酸化、蛋白切断の修飾を受け封入体毒性の本体と考えられている。今年度、私は共著者として、Cullin-2複合体がTDP-43のとりわけ切断C末端のユビキチンリガーゼとして機能し、その除去に重要な役割を担っている事を学会及び誌上で表する事に貢献した。
（２）患者病巣部を用いた解析、ALSモデルマウス及び培養細胞の実験系より、家族性・孤発性を問わずALS進行に小胞体ストレスに対する生体応答（unfolded protein response; UPR）が惹起される事が報告されている。本研究では、小胞体ストレスをリアルタイムで検出する目的で、ルシフェラーゼをベースにした分子プローブの開発を進め、これらプローブについて各種小胞体ストレス試薬や小胞体内でミスフォールドする事により小胞体ストレスを惹起するproteolipid protein 1変異体に対する応答を解析した。
（３）孤発性ALS患者病巣では、核蛋白質であるTDP-43が細胞質内封入体に引き込まれ核から消失する事から、TDP-43の機能欠損がALS発症の鍵を担っていると考えられている。そこでTDP-43遺伝子に対する異なる3種類のsiRNAをHeLa細胞に導入し、各種阻害剤に対するUPRについてウェスタンブロット、リアルタイムPCR並びに小胞体ストレス分子プローブ用いて進め、TDP-43はUPRを制御する可能性を見いだした。更に、このようなUPRの調節を来す分子について、マイクロアレイの結果からスクリーニングし、候補遺伝子の検索を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本研究において、私はこれまでに２点の研究を中心に進めた。（１）ALSの病態解析を目的に、小胞体ストレスをリアルタイムで評価可能なレポーター遺伝子を幾つか樹立し、各種小胞体ストレス誘導薬や小胞体ストレス誘導蛋白質に対する応答を評価した。（２）これらプローブと異なる３種類のTDP-43に対するsiRNAを用いた定量的な解析から、TDP-43によるUPRの調節の可能性を見い出した。これまで患者病巣部やALSモデルマウス、並びに培養細胞を用いた解析からALSの進行に伴いUPRが惹起される事が示唆されていたが、この生体応答はALSの原因か、或は疾患の進行に伴う結果なのか明瞭に示す事はできなかった。それ故、現在までの成果は、ALSにおける小胞体ストレスの役割の解明に貢献し、本研究の方向性を大きく左右するものと考えられる。しかし、当初はこのレポーターをマウスの大脳皮質並びに大脳皮質分散培養に導入し、その表現型を解析する事を目指しており、その意味で進捗状況は計画よりやや遅れていると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
（１）TDP-43遺伝子ノックダウンによる小胞体環境への影響について、更に多種の阻害剤を組み合わせる事により解明する。また、ALSにおけるTDP-43の別の側面として、遺伝子の点変異により家族性ALSを引き起こす事も報告されている。そこで家族性ALSの点変異を持つTDP-43や、家族性ALSの原因として知られており、小胞体ストレスを誘導する事が報告されている変異型Superoxide dismutase 1の表現型についても合わせて解析する。更に、これまでにTDP-43欠損細胞ではオートファジーの機能低下が報告されており、この点も併行して検証する。
（２）研究実績の概要（３）で示した、TDP-43によるUPR制御機構に関連する分子のスクリーニングを進め、その分子基盤の解明を進める。候補遺伝子産物については、これまで同様に培養細胞における強制発現並びにノックダウンに対する表現型の解析を行い、孤発性ALS発症における役割の解明を進める。
（３）（１）及び（２）の知見を神経系の細胞で解明する目的で、マウスの大脳皮質並びに大脳皮質分散培養を用い同様の解析を進める。また神経系での表現型に対する各種阻害剤の効果を調べ、ALS治療に関わる基礎研究を進める。
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| Causes of Carryover |
研究の進行に伴う物品費はほぼ計画通りに使用した。しかし、研究の進捗状況に記載した通り、研究遂行に多少の遅れが生じ、その為年度内の学会発表及び誌上発表に至らず、物品費の内予定していた一部の培養実験及び免疫組織学的実験にかかる経費およそ5万円、学会旅費10万円、並びに論文執筆の際の英文校正等の伴う経費10万円の、総額およそ25万円の未使用額が生じ、次年度に繰り越した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成28年度の直接経費に関わる予定交付額は70万円で、繰り越し分と合わせると総額約95万円となる。前年度からの繰り越し分の内、20万円は当初の計画通りに学会発表の為の旅費及び論文執筆に伴う諸経費に充て、繰り越し分の残り約5万円と新たに交付される70万円は研究遂行の物品費に充てる。
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[Journal Article] CUL2-mediated clearance of misfolded TDP-43 is paradoxically affected by VHL in oligodendrocytes in ALS.2016
Author(s)
Uchida T, Tamaki Y, Ayaki T, Shodai A, Kaji S, Morimura T, Banno Y, Nishitsuji K, Sakashita N, Maki T, Yamashita H, Ito H, Takahashi R, Urushitani M.
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Journal Title
Scientific Reports
Volume: 6
Pages: 19118-19136
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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