2015 Fiscal Year Research-status Report
ERストレスにおけるタンパク輸送抑制へのrER膜局在三量体Gタンパクの関与
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26450408
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| Research Institution | Osaka Prefecture University |
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Principal Investigator |
中川 博史 大阪府立大学, 生命環境科学研究科(系), 助教 (60336807)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 細胞毒性 / ERストレス / 細胞内輸送 / 三量体Gタンパク |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ERストレスが生じた細胞において、ERからGolgi装置までのタンパク輸送(COPII小胞輸送)は抑制されるが、ER膜上でのCOPII輸送小胞の形成がどのように抑制されるのか、制御機構は不明であった。
平成27年度本研究計画に基づき、ERストレスを惹起された細胞において、COPII小胞を構成するために必要なコートタンパク群のER膜上への集積がどのように抑制されているのかについて解析を行った。ER膜上でCOPII小胞を形成するためには、細胞質からER膜上へと(1)Sar1、(2)Sec23/24、(3)Sec13/31のCOPIIコート構成タンパクが順次移動する。そこでER膜と細胞質からなるcell free実験系（ミクロソーム結合実験）を用いて、細胞質からER膜へのCOPIIコート構成タンパクの移動を観察する必要がある。抗ラットSar1抗体は市販されているものに適切なものが存在せず、自作を行った。過去に作成し保有しているラットSar1b全長発現プラスミドより、抗原蛋白を得、抗ラットSar1ウサギポリクローナル抗体を作成した。
また、もう一方の研究計画の項目であるERストレスにおけるCOPII小胞形成へのER膜局在三量体Gi2タンパクの関与の証明については、siRNA法による三量体Giα2タンパクノックダウン細胞の作出を試みた。ノックダウン条件検討を行い、siRNAによるGiα2タンパクの発現レベルを20%程度に抑制した細胞の作出に成功し、tunicamycin処置によるERストレス誘導を行った結果、ERストレスマーカーであるgrp78発現の有意な抑制が観察されている。また十分な例数を揃えられていないが、ERストレスセンサー経路の中のPERK-IRE1経路の活性化の抑制が起こっていることを示すデータが得られている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
平成27年度研究計画の中で、ERストレスによるCOPII小胞形成過程への影響を調べる項目について、COPII小胞コート形成の3段階の過程において、ERストレスの影響を調べる計画であった。現在、3段階の過程の中で最初のステップであるSar1の移動について、今回作成し得られたSar1抗体を用いて十分な例数の実験を行った結果、Sar1の移動についてはERストレスの影響は無いという結果が得られているが。2段階目のSec23/24の移動および3段階目のSec13/31の移動についてはまだ実験が進んでおらず、結論を得ることが出来ない状態である。
もう一方の研究計画の項目であるERストレスにおけるCOPII小胞形成へのrER膜局在三量体Gi2タンパクの関与の証明についてはtunicamycin処置ERストレス誘導時に、三量体Gi2タンパクノックダウン細胞においてERストレス応答が抑制されることを見出しており、研究の進捗は順調であると考えている。一方で、ノックダウンを用いた手法には限界があり、Gi2タンパクのノックアウト細胞の作出にも取り掛かっている。CRIPR/Cas9プラスミドの構築は完了したが、ターゲットであるNRK細胞は大きなプラスミドをリポフェクション法で導入するには困難な細胞として知られており、実際に7種類のトランスフェクション試薬を試みたが、その全てでプラスミド導入に失敗している。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成27年度に、tunicamycinによりERストレス時にGi2タンパクノックダウン細胞でgrp78発現誘導の抑制が生じることを見出した。ERストレスセンサーにはPERK経路、IRE1経路、ATF6経路の3つの経路があることが知られており、Gi2タンパクがこれら3経路のどの経路へ関与するかを検討する。現在PERK経路への関与を示唆するデータを得ているため、PERK経路に関してはより詳細な検討を行えると考えている。具体的にはさらに下流のシグナル因子であるeIF2a、GADD34、ATF4およびCHOP等の変化についても、検討を行う予定である。
Gi2タンパクノックアウト細胞の作出を試みる。現在NRK細胞へのCRISPR/Cas9プラスミドの導入に成功しておらず、新たなリポフェクション試薬を試す。また、リポフェクション法が不可能だった場合に備えて、並行してエレクトロポレーションでのプラスミド導入を試みる。ノックアウト細胞の作出に成功次第、平成28年度実施予定項目であったERストレスセンサーのER膜上での結合タンパクの変動について解析を行う。またGi2タンパクとgrp78タンパクのER膜上での共局在について、形態的な観察を行い検討を行う。
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| Causes of Carryover |
CRISPR/Cas9系を用いたノックアウト細胞作成に手間取り成功しなかった為、最終的な目標であるERストレス応答におけるGi2タンパクの関与の実験の実施に至らなかった。そのため28年度に予算を繰り越すこととなった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成28年度にCRIPSR/Cas9を用いたGi2タンパクノックアウト細胞を作成する。ノックアウト細胞の作出（各種リポフェクション試薬の試行および不可能だった場合にエレクトロポレーションを実施する）および作出細胞のクローニングに概算で約30万円を必要とする。
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