わが国の野生鹿における志賀毒素産生大腸菌の保菌状況と分離株の病原性評価

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26450412
• Research Institution: Nihon University
• Principal Investigator: 壁谷 英則 日本大学, 生物資源科学部, 准教授 (10318389)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 丸山 総一 日本大学, 生物資源科学部, 教授 (30181829) ; 横山 栄二 千葉県衛生研究所, その他部局等, その他 (40370895)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 志賀毒素産生大腸菌 / 鹿 / ジビエ / 食中毒

Outline of Annual Research Achievements

平成26年度は、従来より収集を開始している検体を含め、平成25年10月から平成27年3月までに、わが国の10道府県より得られた計114検体の鹿糞便材料のうち、90検体を用いた。１0％糞便乳剤を作成し、直接マッコンキー培地に接種して志賀毒素産生大腸菌(以下STECとする)の分離培養を試みた。さらには同材料をmEC培地に接種して増菌培養をした後、クロモアガーO157、ならびにCT-SMAC寒天培地にて分離培養を行った。得られた大腸菌について、PCRによりstx遺伝子の検出された株をSTECとした。
その結果、全体では16検体(17.8％)からSTECが分離された。鹿の性別では、雄で7.5％(3/40)、雌で26.3％(10/38)、性別不明で25％(3/12)であった。季節別では、秋で6.3％(1/16)、冬で19.4％(12/62)、および春で25％(3/12)であった。地域別では、北海道で0％(0/13)、関東で36.4％（4/11）、中部で37.5％（3/8）、関西で0％（0/32）、四国で31.3％（5/16）、九州で40％（4/10）であった。
さらに得られたSTEC分離株について、O157血清を用いた血清凝集試験を実施したところ、1検体（1.1％）が陽性となった。今後、O157以外の血清型についてはO-genotypingを実施した後、想定される血清を購入し、血清凝集試験により確認を行う。現在、さらに病原関連遺伝子として、各種接着因子、ならびに志賀毒素遺伝子バリアント、および系統型別を実施している。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究では、日本全国で捕獲された野生鹿を対象として志賀毒素産生大腸菌（STEC）の分離を行い、得られた鹿由来STEC分離株について、1）O-genotypingによる血清型別、2）24種類の病原関連遺伝子を総合的に解析するPCR-binary typing system（P-BIT）による病原性評価、ならびに3）全ゲノム解析による人ならびに牛由来STECとの比較ゲノム解析、以上3点に絞って研究を実施する計画である。これらの目的のため、平成26年度では、①検体の収集、②STECの分離培養、③生化学性状解析、および④STEC分離株のO-genotypingを実施する計画であった。また、検体収集の目的として、「広く全国の都道府県（少なくとも各地区を網羅する）からの採材を試み、各地点で20-50検体程度の採材を目標とする。」としていた。これに対し、従来より収集している材料を含め、平成25年10月から平成27年3月までに、わが国の10道府県より得られた計114検体の鹿糞便材料を収集し、地域別ではそれぞれ北海道：13、関東16、中部15、関西32、四国28、九州10検体を収集し、一部検査中のものを含めて検査が順調に進んでいる。さらに、これまでのところ、全体でSTEC陽性率17.8％と分離株も順調に収集できており、来年度以降の病原性解析に使用できる。さらには、O157 STECも1検体（1.1％）より分離されており、当該研究計画前に採取していた1株を含め2株の鹿由来O157 STECを保存できた。これより、最終年度に予定している鹿由来O157 STECの比較ゲノム解析についても実施することができる見通しができた。

Strategy for Future Research Activity

平成27年度は、引き続き、①検体の収集、②STECの分離培養、③生化学性状解析、④STEC分離株のO-genotypingについては、平成27年度も引き続き実施する。これまでに概ね計画通りわが国の多くの地域から広く検体採取を実施しているが、今後もより広い地域からの採材協力を試みることを計画している。特に、これまでに検討できていない、東北地方をはじめ、検体数の比較的少ない北海道、関東、中部、九州地方については新たな研究協力を要請することを検討する。
一方、平成27年度より得られた分離株の病原性解析を進めることを計画している。すなわち、志賀毒素、溶血性、TypeⅢ分泌機構、細胞接着などに関わる24種類の病原関連遺伝子の有無をPCRにより解析し、その保有パターンのクラスター解析を行う。

Causes of Carryover

当初の計画では、平成26年度から分離株の生化学性状試験を実施するとともに、O抗原、ならびにH抗原血清型別試験を一部実施することとしており、この血清型別試験では、特に高価な抗血清を必要とするため、予算を配置した。しかしながら血清型別試験の実施は、分離株の収集が一定数すんでからの実施が効率的であると判断し、実施していないことから、血清を購入していなかったため、このような差額が生じたと考えられる。

Expenditure Plan for Carryover Budget

平成27年度では、次年度使用額を含め、1）運搬費、2）旅費、3）消耗品費似て使用する。1）運搬費については、検体収集を頻度、ならびに採取カ所ともに広げることにより、検体の輸送代として使用する。2）については、検体収集を目的として、これまでの施設に加え、新たに九州地方での、野生鳥獣処理施設を訪問し、研究協力の依頼をする。3）消耗品としては、病原大腸菌免疫血清の購入を予定している。さらに選択増菌培地、ならびに選択分離培地の追加購入や、遺伝子検索のための各種試薬の購入が必要である。一定の研究成果が得られた際には、学会発表する際の交通費としての支出も計画している。