2015 Fiscal Year Research-status Report
サイクロスポリンによるネコ伝染性腹膜炎ウイルスの複製阻害機構の解析
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26450413
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| Research Institution | Nippon Veterinary and Life Science University |
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Principal Investigator |
田中 良和 日本獣医生命科学大学, 獣医学部, 准教授 (50291159)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | ウイルス感染症 / ネコ伝染性腹膜炎 / シクロフィリン / サイクロスポリン / ウイルス複製 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
伴侶動物のネココロナウイルス（FCoV）感染症による，ネコ伝染性腹膜炎(FIP)はワクチン開発が未だ成功しておらず，一度発症すると致死的な経過をたどる．また，一般に臨床で行われているステロイド剤やインターフェロン投与では治癒率が極めて低い．このため，臨床現場ではFIPに対する新たな予防薬・治療薬の開発が切望されている。
先行実験結果でサイクロスポリン（CsA）がFCoVの複製を阻害することを明らかにしたので、CsAに結合する細胞内シクロフィリン（Cyp）AおよびBのノックアウト（KO）細胞を遺伝子改編システムであるCRISPR/Cas9システムで樹立し、FCoVの増殖に対する影響を解析した。その結果、CypAおよびCypBの各KO細胞においてFCoVの複製が抑制された。また、CypAおよびCypBのプロリン・イソメラーゼ活性に対するドミナントネガティブ遺伝子をネコ由来fcwf-4細胞に発現させ、FCoVの複製効率を解析した結果、FCoVの複製が抑制されることがわかった。
一方、Cypと同様なプロリン・イソメラーゼ活性を有するPin1を細胞に強制発現させるとFCoVの複製が増強された。そのため、Pin1特異的な阻害剤であるDTM存在下でFCoVを感染させると容量依存性にウイルス複製が阻害された。次いでPin1のKO細胞を樹立し、FCoVを感染させたところ、ウイルス複製が抑制された。
これらの結果から、FCoVの複製には細胞蛋白質のイソメラーゼ活性が重要であることがわかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
FCoVの複製におけるCypおよびPin1の役割を解析する目的でfcwf-4細胞で各遺伝子のノックアウト細胞を樹立でき、これらの細胞を用いてFCoV複製時におけるプロリン・イソメラーゼ活性の重要性を明らかにすることができた。
しかしながら、ウイルスゲノムにレポーター遺伝子を有するミニレプリコンの作成に時間を要し、現在、作成中である。
次年度においてミニレプリコンの作成を引き続き行い、ウイルス複製を定量化できるシステムの構築を行う予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
Cyp遺伝子およびPin1遺伝子のダブルノックアウト細胞を樹立し、FCoVの複製効率を解析する。また、ウイルスミニレプリコンを作成し、遺伝子複製効率の新たな定量系を確立するための実験を行う予定である。
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| Causes of Carryover |
実験に使用した試薬、プラスティック類がメーカーのキャンペーン価格あるいはアウトレット商品価格で購入したため、予想以上大幅に予算を節約することができた。このため、当該助成金が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
来年度はウイルスや宿主蛋白質に対する抗体作成費用（外注）、タンパク質間の結合を解析するための質量分析費用に多くの予算が必要とされる。また、海外での学会発表を予定しており、その旅費等に経費が必要となる。
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