2014 Fiscal Year Research-status Report
DNAメチル基転移酵素アクセス可能領域の探査 ～インプリント機構解明に向けて～
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26450449
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| Research Institution | Tokyo University of Agriculture |
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Principal Investigator |
尾畑 やよい 東京農業大学, 応用生物科学部, 准教授 (70312907)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | ゲノミックインプリンティング / DNAメチル化 / 発生 / エピジェネティクス / DNAメチル基転移酵素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
インプリントの確立に不可欠であり、生殖細胞形成過程でのみ共発現するDNAメチル基転移酵素DNMT3A2およびその補酵素DNAMT3L（DNMTs）が、膨大なゲノムの中からインプリント領域をメチル化する機構は明らかでない。本研究ではDNAメチル基転移酵素アクセス可能領域を探査することを最終目標とし、平成26年度は、DNMTsを体細胞分裂期で恒常的に発現するTgマウスの表現型および遺伝子発現解析を実施した。
卵形成過程から胚盤胞期までが外来性DNMTsが発現するTgマウス由来胚では、野生型マウス由来胚と比較して、産仔数が減少する傾向が認められたが、これらのマウスの表現型や生存性に顕著な異常は認められなかった。
胚盤胞期から外来性DNMTsが発現し続けるTg胚では、野生型胚と出生率に差は認められなかったが、出生後、このTgマウスの発育は有意に阻害され、Tgのラインによらず、いずれも2～20週齢の間で致死となることが明らかとなった。Western Blot解析の結果、本来、内在性DNMTsは、受精後2細胞期までにタンパク質レベルで検出できなくなるが、このTgマウス（週齢）の脳、心臓、肺、腎臓、筋肉などではDNMTsの発現が検出された（野生型マウスの臓器では非検出）。さらに解剖学的所見で多くのTgマウスで心肥大が検出されたことから、心臓のRNAをマイクロアレイにより解析した（Tg n=5、野生型 n=3）。その結果、野生型マウスの遺伝子発現レベルと比較して全てのTgマウスで共通して5倍以上差次的発現を呈する遺伝子が12存在した。興味深いことに、これらの中にインプリント遺伝子は検出されなかった。qRT-PCRによりインプリント遺伝子群と差次的発現を呈する6遺伝子の発現を解析した結果、マイクロアレイの結果とほぼ一致することが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成26年度は計画調書に準じて、DNMTs-Tgマウスの表現型解析、DNMTsのタンパク質発現解析、網羅的遺伝子発現解析が全て完了した。現在、Tgマウスと野生型マウスで差次的発現を呈する遺伝子群のCpGアイランドやプロモーター領域を既存のデータベースで検索しており、平成27年度に行うべきDNAメチル化解析について、研究遂行を妨げる要因は今のところ見当たらない。研究は概ね順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
生殖細胞形成過程でインプリントを確立する為には、インプリント領域がDNMTsとアクセス可能な状態に変化する必要がある。しかし、この状態がどのようなクロマチン状態によるものかは不明である。DNMTsがアクセス可能なクロマチン状態を解明することを最終的な目標として、本研究ではまず、DNMTsアクセス可能領域を探査する。平成27年度は以下の研究を実施する。
1）Tgマウスと野生型マウスで差次的発現を呈する遺伝子群のDNAメチル化解析 3倍以上差次的発現を呈する遺伝子群が多数に及ぶことから、発現差が大きいもの、差次的発現を呈する遺伝子群で形成されるPathwayの中でそのカスケードの上流に位置するものを選出する。Tgマウスおよび野生型マウスの心臓よりDNAを抽出し、先の方法で選出された遺伝子群のCpGアイランドやプロモーター領域について、sodium bisulfite sequencing法によるメチル化解析を実施する。
2）インプリント遺伝子のDNAメチル化解析 アレル特異的な解析が可能なように、亜種マウスJF1系統とTgマウスを交配させ、同腹のTgマウスと野生型マウスの心臓からDNAを抽出する。インプリント領域（H19/Igf2、Igf2r、Lit1、Snrpn、Mestなど）について異常なDNAメチル化が生じていないかどうか解析する。
3）DNAメチル化異常の発生時期の追跡 1）において心臓で顕著にメチル化レベルが変動している遺伝子を2～3ヶ抽出し、出生時、妊娠後期、妊娠中期、妊娠初期、胚盤胞期へとTgマウスの発生をさかのぼり、このDNAメチル化異常がいつ生じるのか明らかにする。
以上の解析で、DNMTsが発生過程でいつどの領域にアクセス可能になるのかを突き止める。
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| Causes of Carryover |
Tgマウスの表現型解析やトランスクリプトーム解析が当初の予定より少ない支出で進めることができた。その助成金により次年度以降の解析の範囲を拡充し、Tgマウスでより多くの遺伝子のDNAメチル化解析をおこなうことで、より多くの情報を得るため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成26年度の解析で、DNAメチル化に異常が生じている可能性のある領域は非常に広汎に及ぶ可能性がある。より多くの領域について検証を行いたいが、限られた予算内で解析する必要がある。平成26年度で抑えられた支出の分の助成金を、平成27年度使用することで、より多くの領域のDNAメチル化解析を実施し、DNMTsアクセス可能領域に対するより多くの知見を得る。この分の助成金は、DNAメチル化解析の為の試薬（物品費）および解析の一部を外部委託する際の費用（その他）として計上する。
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| Remarks |
現在、準備中です。
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