2015 Fiscal Year Research-status Report
B.thuringiensis Cry44Aaトキシンのカ類殺虫活性機構の解明
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26450463
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
浅野 眞一郎 北海道大学, (連合)農学研究科(研究院), 准教授 (60222585)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | Cry44Aa / アルカリフォスファターゼ / アミノペプチターゼＮ / ＡＴＰ結合カセットトランスポーター / レセプター / バキュロウイルス / ネッタイシマカ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
イエカ（Culex sp.)ならびにシマカ(Aedes sp.)に対して強い殺虫活性をもつentomocidus INA288由来のCry44Aaの殺虫活性機構解明のために、ネッタイシマカ(Aedes aegypti)からレセプター候補分子として、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）、アミノペプチターゼＮ（ＡＰＮ）、ＡＴＰ結合カセットトランスポーター（ＡＢＣ transporter）、カドヘリン様タンパク質（Cad-like）をクローニングし、それぞれのタンパク質に対するCry44Aaトキシンの結合を観察した。
その結果、中腸上皮細胞での各タンパク質の発現が観察されたので、各タンパク質のクローニングを行い、大腸菌発現系を用いて発現させて、Cry44Aaトキシンとのオーバーレイアッセイならびにプルダウンアッセイにより結合を調査した。その中でＡＬＰ１とＡＬＰ３が強い結合性を示した。
これらのレセプターとしての機能を解析するために、バキュロウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）発現系を用いて、Cry44Aaトキシン感受性でないヨトウガ由来の培養細胞（Ｓｆ細胞）にて発現させた。発現確認の為に、各レセプター分子にＦＬＡＧタグをつけ、細胞表面での発現をＦＬＡＧタグの抗体で検出したところ、発現が確認できた。
この各レセプター分子を発現させた、Ｓｆ細胞を用いてCry11Aaトキシン、Cry44Aaトキシン、Cry1Aaトキシンをアッセイすることで、各レセプター分子の機能について調査を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ネッタイシマカのCry44Aaトキシンレセプター候補分子のクローニングおよび大腸菌での発現、発現産物とトキシンとの結合調査（オーバーレイアッセイ＆プルダウンアッセイ）、バキュロ発現系での昆虫培養細胞（Ｓｆ細胞）での発現、Cryトキシンによる細胞損傷調査は順調に進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
もう一つのCry44Aaトキシンのターゲットとなるイエカについては、入手出来次第、レセプター候補分子（ＡＬＰ、ＡＰＮ、ＡＢＣ transporter、Cad-like）タンパク質遺伝子をクローニングし、その機能について調査する。
Ｓｆ細胞でのレセプター機能解析で、レセプター分子が絞り込めれば、生体内でのＲＮＡｉ等のノックダウンでレセプター分子の機能調査ができると考えられる。
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| Causes of Carryover |
３月納品の消耗品が反映されていない。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
すでに、３月に消耗品として使用済みである。
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