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2014 Fiscal Year Research-status Report

転写因子DAF-16/FOXOによる寿命延長機構のin vivoにおける解明

Research Project

Project/Area Number 26450500
Research InstitutionUniversity of Tsukuba

Principal Investigator

大徳 浩照  筑波大学, 生命環境系, 講師 (30361314)

Project Period (FY) 2014-04-01 – 2017-03-31
Keywords寿命 / 老化 / 転写因子 / FOXO / DAF-16 / 線虫
Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的は、独自に構築した線虫のin vivo lucシステムを駆使して、DAF-16をはじめとする長寿転写因子の活性を直接的・定量的に評価するとともに、それら転写因子による寿命延長メカニズムの解明を目指すものである。平成26年度の研究成果は以下の通りである。
1. daf-2長命変異体におけるDAF-16の活性と寿命延長との相関を検証すべく、DAF-16応答性Lucレポーター遺伝子を導入した線虫をdaf-2長寿変異体と掛け合わせ、そのLuc活性を野生型と比較した。意外なことにLuc活性に差はみられなかったが、Luc遺伝子のmRNA量は上昇していた。この結果はdaf-2変異体でDAF-16の転写活性は亢進していることを示すとともに、同変異体でグローバルに翻訳レベルが低下するという先行報告に一致する。
2. 様々な長寿シグナルにおける寿命調節転写因子の活性制御機構の解明するため、他の長寿転写因子であるSKN-1の活性化に応答する線虫の樹立し、現在その有用性を検証している。またDAF-16応答性Luc線虫は飢餓ストレスで転写が活性化するが、RNAi法により、このシグナルがTORを介していることが明らかになった。
3. in vivoにおけるDAF-16の翻訳後修飾の同定とその機能的意義の解析するため、FLAG-HA タグ付きのDAF-16を安定発現するトランスジェニック線虫を用いて、翻訳後修飾の同定を試みている。一方、培養細胞に発現させたDAF-16をアセチル化リジン抗体で精製し、MALDI-TOF/TOF MSに供することで、3カ所のアセチル化部位を同定した。現在までに、このうち2カ所についてリジンをアルギニンに置換した変異体を作製し、転写活性を評価している。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

申請時に計画していた遺伝子組換え線虫は全て樹立済みであり、すでに解析を始めている。
またDAF-16の翻訳後修飾部位の同定にも成功しており、現在検討を行っている線虫からのDAF-16タンパク質の精製条件が整えば、さらなる進展が期待できる。

Strategy for Future Research Activity

今年度以降は、すでに確立したLuc線虫を用いてDAF-16の活性化に関わるシグナル経路を同定するとともに、線虫からDAF-16タンパク質の精製して翻訳後修飾部位の同定を試みる。
また申請内容には記載しなかったが、CRISPR-Cas9システムによる線虫のゲノム編集にも成功しており、現在、DAF-16の転写活性化ドメインを欠失した変異体の作製にも取り組んでいる。

  • Research Products

    (4 results)

All 2015 2014

All Journal Article (1 results) (of which Peer Reviewed: 1 results) Presentation (3 results)

  • [Journal Article] Detection of choline and phosphatidic acid (PA) catalyzed by phospholipase D (PLD) using MALDI-QIT-TOF/MS with 9-aminoacridine matrix2014

    • Author(s)
      Park KE, Kim JD, Nagashima Y, Kako K, Daitoku H, Matsui M, Park GG, and Fukamizu A.
    • Journal Title

      Biosci Biotechnol Biochem.

      Volume: 78 Pages: 981-988

    • DOI

      10.1080/09168451.2014.910102.

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] 長寿変異体における転写因子DAF-16の転写活性化能の評価2015

    • Author(s)
      新生 翔, 大徳 浩照, 金子 悠太, 廣田 恵子, 深水 昭吉
    • Organizer
      冬の若手ワークショップ 2015
    • Place of Presentation
      ホテル松本楼(群馬県渋川市伊香保町)
    • Year and Date
      2015-02-06 – 2015-02-06
  • [Presentation] 長寿転写因子DAF-16のin vivoにおける制御機構の解明2014

    • Author(s)
      米野 千尋, 新生 翔, 大徳 浩照, 金子 悠太, 深水 昭吉
    • Organizer
      第87回 日本生化学会年会
    • Place of Presentation
      京都国際会館(京都市左京区)
    • Year and Date
      2014-10-17 – 2014-10-17
  • [Presentation] 紫外線DNA損傷応答におけるフォークヘッド型転写因子FOXO1/DAF-16の役割2014

    • Author(s)
      金子 悠太, 大徳 浩照, 吉用 賢治, 松本 佳保里, 米野 千尋, 深水 昭吉
    • Organizer
      第87回 日本生化学会年会
    • Place of Presentation
      京都国際会館(京都市左京区)
    • Year and Date
      2014-10-17 – 2014-10-17

URL: 

Published: 2016-05-27  

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