2016 Fiscal Year Annual Research Report
In vivo analysis of longevity mechanism of transcription factor DAF-16/FOXO
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26450500
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| Research Institution | University of Tsukuba |
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Principal Investigator |
大徳 浩照 筑波大学, 生命領域学際研究センター, 講師 (30361314)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 寿命 / 老化 / 転写因子 / 線虫 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、独自に構築した線虫のin vivo lucシステムを駆使して、DAF-16をはじめとする長寿転写因子の活性を直接的・定量的に評価するとともに、それら転写因子による寿命延長メカニズムの解明を目指すものである。最終年度の研究成果は以下の通りである。
1. daf-2長命変異体におけるDAF-16の活性と寿命延長との相関を検証すべく、DAF-16応答性Lucレポーター遺伝子を導入した線虫をdaf-2長寿変異体と掛け合わせたところ、予想通りLuc活性が野生型と比較して有意に上昇していた。
2. 同システムを用いてストレスに対するDAF-16の応答性を検討した結果、熱ストレスや飢餓ストレスでDAF-16の活性が亢進することが明らかになった。またこの時、DAF-16は核に局在し、Aktによるリン酸化は顕著に減弱していた。一方で、DAF-16の標的として報告されているいくつか遺伝子の発現パターンは必ずしもDAF-16の活性と相関していなかった。以上の結果は、本システムがDAF-16のin vivoにおける活性を評価する上で優れた実験系であることを示している。
3. in vivoにおけるDAF-16の翻訳後修飾の同定とその機能的意義の解析するため、FLAG-HA タグ付きのDAF-16を安定発現するトランスジェニック線虫を用いて、翻訳後修飾の同定を試みた。3種類のプロテアーゼを組み合わせてタンパク質を断片化することで、MALDI-TOF-MS/MSによる分析のカバレッジを高め方法を確立した。またリン酸基を特異的にトラップするカラムを通すことで、高効率にリン酸化部位を同定することも可能になった。
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