2015 Fiscal Year Research-status Report
合成生物学的手法による酵母及びヒトタンパク質分泌シグナル配列の厳密な定義と最適化
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26450505
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| Research Institution | Yamaguchi University |
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Principal Investigator |
星田 尚司 山口大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (00314823)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 分泌シグナル / Kluyveromyces marxianus / イヌリナーゼ / GLuc |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Kluyveromyces marxianusで決定したルシフェラーゼタンパク質（GLuc）の分泌に適したM-K-Mx16-E配列などの人工配列の分泌能をヒト培養細胞で比較した。その結果，全体的な傾向は似ており，分泌能力はリシンとグルタミン酸に挟まれた領域のアミノ酸残基の長さに依存する傾向が見られた。しかし，K. marxianusの場合と異なり，GLucのもともとのシグナル配列と同等の能力を示す人工配列は存在したが，それを超えるものは無かった。このことはヒト細胞にとってはネイティブGLucシグナルが効率的なシグナル配列であることを示唆しており，K. marxianusとは効率的シグナル配列が異なることを示している。
K. marxianusにおいてより分泌に優れた人工配列を探索するために，疎水性領域を単一のアミノ酸残基から，いくつかのアミノ酸配列の組みわせに変更して分泌能を調べた。その結果，多くの場合GLuc分泌活性が低下した。この結果から，メチオニン残基に特別な能力が与えられていることが考えられた。
シグナル配列による分泌調節の可能性を明らかにする目的で，K. marxianusが大量に分泌するタンパク質としてイヌリナーゼを同定し，イヌリナーゼの分泌生産条件を解析した。イヌリナーゼはキシロース培地で発現量が増加した。さらに，様々な条件での生産を調べた結果，溶存酸素濃度を高く保った条件でイヌリナーゼ生産量が高いことを明らかにした。イヌリナーゼが分泌されやすいタンパク質であること，大量生産できる条件を決定できたことから，この条件ではイヌリナーゼは抑制を受けずに，言い換えるとどの過程でも律速にならずに分泌経路を通過していると考えられる。従って，酵母でシグナル配列能力を評価するのに適した条件を得られたといえる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
K. marxianusでシグナル配列によるタンパク質分泌生産調節を解析するためのモデルタンパク質としてイヌリナーゼを同定し，キシロースを炭素源とする培地で溶存酸素を高く保って培養した時に大量に分泌生産されることを明らかにした。これにより，平成27年度の目的の一つを達成した。もう一つの目的であるシグナル配列の最適化に関しては，リシンとグルタミン酸に挟まれた疎水性ストレッチの長さに関して，既に疎水性配列として各アミノ酸残基について最適な数を決定できている。一方でK. marxianusのイヌリナーゼと同様に，ヒト培養細胞でシグナル配列による分泌生産調整機構を調べるためには，ヒト細胞で大量に分泌可能なモデルタンパク質を決定する必要があるものの，その決定には至っていない。これに対し，平成28年度の目的であった酵母で生産困難なタンパク質の分泌生産に関して，もともとのシグナル配列では分泌生産できなかったヒト由来タンパク質に対してM-K-Mx16-E配列を用いることで，K. marxianusでの分泌生産に成功しており，M-K-Mx16-E配列が汎用性的に利用できることを示す結果を得ている。従って，平成28年度にヒト分泌生産タンパク質のモデルの決定も含めて研究を実施することが可能であるので，全体としておおむね順調に進んでいるとした。
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| Strategy for Future Research Activity |
K. marxianusにおいてイヌリナーゼを指標として分泌シグナル解析を行うために，ネイティブのイヌリナーゼ遺伝子を破壊し，この株に対してK. marxianusゲノムから選んだ種々のシグナル配列を付加したイヌリナーゼ遺伝子を導入し，発現量を比較する。ヒト培養細胞でも，大量分泌可能なタンパク質を選択し，シグナル配列に依存した分泌量の変化が起こるかどうか解析を行う。これまでの結果では酵母とヒトでシグナル配列の効果が異なることを示唆する結果が得られており，両生物でシグナルによる調節も異なる可能性がある。
M-K-Mx16-E配列を基本に長さやアミノ酸残基の異なるシグナル配列を用いて，この配列が分泌に優れている理由の解析を行う。N末のリシンとグルタミン酸に挟まれた領域としてメチオニンが適している理由は不明である。分泌効率の異なる人工シグナル配列を付加した蛍光タンパク質を発現させ，細胞内での動態や，シグナル配列を介したタンパク質の分泌必須とされている遺伝子の温度感受性株での変化を観察するなどしてその理由を探る。
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Research Products
(2 results)
