2016 Fiscal Year Annual Research Report
Analysis of phosphorylation signal using a Phos-tag quencher
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26460036
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
小池 透 広島大学, 医歯薬保健学研究院(薬), 教授 (90186586)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 蛍光分析 / リン酸化プロテオミクス / 消光性分子 / フォスタグ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
現在，複雑な生体試料中のリン酸化蛋白質の選択的な検出には，抗リン酸化抗体が汎用されているが，それらはリン酸化分子を網羅的に捕捉することはできない。また，リン酸化ペプチドなどの低分子を捕捉・濃縮するリン酸親和性担体はいくつか市販されているが，いずれも選択性は低く，また担体からの分離には酸性やアルカリ性の条件と有機溶媒が必要である。一方，本研究で開発する消光性フォスタグ誘導体は，生理pHの水溶液中でリン酸化分子を分解することなく，可逆的かつ網羅的に捕捉する機能を持っている。平成28年度は，平成26, 27年と同様の研究方法でスペーサーなどを改良した新規消光性フォスタグの合成を継続した。さらに，創薬や病態診断分野で注目されている人腎臓や小腸などに分布するフォスファターゼ基質の蛍光標識体を用いた様々なリン酸化シグナル解析の検討を行った。リン酸化量の経時変化を新規フォスタグ分子の消光率の増加を指標として解析した。この方法により，キナーゼ阻害剤のシーズ探索が可能になると考えている。また，マイクロプレートレベルの試料溶液量に適した蛍光性リン酸化ペプチド基質含有分析試料を調製することにより，ハイスループットかつ大規模な阻害剤のスクリーニングや臨床検査システムの構築した。さらに，疎水性面メンブレンやマレイミド結合型プレートなどへの消光性質フォスタグの固定化条件を検討した。今後それらを用いたリン酸化タンパク質の選択的ゲル染色法や定量分析システムを開発していく予定である。また，本研究の成果から，新たな消光システム（TAMRA/TAMRA quenching system）を見出し，それらがより簡便かつ実用的なリン酸化状態の検出法として利用できることが明らかとなった。今後次の研究テーマとしてそれらの実用化研究を継続する予定である。
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