2015 Fiscal Year Research-status Report
NMRを用いたエイコサノイド代謝関連膜タンパク質群の動的構造解析
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26460038
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| Research Institution | Yokohama City University |
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Principal Investigator |
坂倉 正義 横浜市立大学, 生命医科学研究科, 助教 (20334336)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
高橋 栄夫 横浜市立大学, 生命医科学研究科, 教授 (60265717)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 構造生物学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
リコンビナントFLAPが天然に近い状態で存在すると考えられる脂質二重膜中においてNMRを用いた構造解析、相互作用解析を行うことを目的として、Nanolipoprotein particle（NLPまたはナノディスク）中にFLAPを再構成するための条件検討を行った。この結果、POPC/POPG混合脂質を用いて調製したNLP中にFLAPを再構成することに成功した。次に、NLP中に可溶化したFLAP（以下FLAP/NLP）について、サイズ排除クロマトグラフィーによる5-lipoxygenase (5-LO)との相互作用解析を行った。しかし、相互作用形成に伴うFLAP/NLPおよび5-LOの溶出位置の変化は観測されなかった。解析対象の5-LOとして、これまでに結晶構造が報告されている安定化変異体を用いたが、この変異体において、脂質膜との相互作用形成に重要であると考えられている疎水性残基が親水性残基に置換されていることが、相互作用が観測されなかった要因の一つと考えられる。一方、FLAP/NLPと阻害剤との相互作用解析を行うため、メチオニン及びイソロイシンのメチル基に選択的に安定同位体標識（13C）を導入したFLAPを調製し、NLPに再構成した状態でNMRスペクトルを測定した。この結果、FLAPに由来すると考えられるシグナルが観測された。次に、FLAP/NLPに対して阻害剤であるMK-591を添加して、NMRスペクトルの変化を解析した。この結果、メチオニンに由来すると考えられるシグナルについて、MK-591添加に伴う強度減少が観測され、脂質二重膜中におけるFLAPとMK-591の結合が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
NLP（ナノディスク）技術を応用することにより、FLAPを脂質二重膜中に可溶化した状態で、水溶性粒子として取り扱うことが可能となった。この結果、界面活性剤を全く含まない条件において、水溶性タンパク質である5-LOとの相互作用解析を行うことが可能となった。しかし、NLPはNMRによる観測対象粒子としてはサイズが大きく、感度が高いメチル基を標的とした解析を行った場合でも、全ての残基に由来するシグナルを観測することができなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
１、5-LOの安定化変異を野生型に戻したReversed mutantを調製し、FLAPとの相互作用解析を行う。
２、FLAP/NLPのNMR解析を行うため、(a) NLPの最小化を行うための条件検討、(b) bicelle等、FLAPを脂質二重膜中に可溶化するNLP以外の手法の検討、(c) タンパク質 and/or 脂質の重水素化によるNMR測定感度上昇の検討 を行う。
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| Causes of Carryover |
リコンビナントタンパク質の完全重水素標識を行うために、重水を購入するための予算を確保していたが、専ら重水を使用しない部位選択的重水素標識サンプルを調製したため、重水用に確保した予算を消費しなかった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
NLP（ナノディスク）の調製において必要となる、合成脂質（POPC、POPG等）の購入に、予算を振り分ける。
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