2014 Fiscal Year Research-status Report
固相マイクロ抽出法に基づく生体酸化損傷マルチマーカーの同時分析システムの開発
| Project/Area Number |
26460053
|
|---|
| Research Institution | Shujitsu University |
|---|
Principal Investigator |
片岡 洋行 就実大学, 薬学部, 教授 (80127555)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
|
| Keywords | 固相マイクロ抽出法 / オンライン自動分析 / 酸化ストレス / バイオマーカー / LC－MS/MS分析 / 8-OHdG / 8-イソプロスタン / 3-ニトロチロシン |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
平成26年度は、実施計画に基づき、様々な疾病発症の引き金になるDNAや脂質、蛋白質の酸化損傷を捉える複数の生体酸化ストレスマーカーを簡便迅速に同時計測するために、インチューブ固相マイクロ抽出(SPME)／液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析(LC－MS/MS)法による高感度なオンライン自動分析システムを考案開発した。
1 DNA酸化で生じる8-OHdG、脂質酸化で生じる8-イソプロスタン(8-IP)、蛋白質酸化で生じる3-ニトロチロシン(3-NT)を分析対象として、インチューブSPME条件を最適化した結果、検討したGCキャピラリーの中でCarboxen 1006 PLOTが最もよく、試料40μLを200μL/minの速度で20回繰返し吸入／吐出する時、効率よく抽出できた。
2 インチューブSPME／LC－MS/MS法の分析条件としては、CXカラムを用いる時いずれの化合物も12分以内に一斉分析でき、8-IPはネガティブモード、8-OHdGと3-NTはポジティブモードに切り替え連続してMRM検出することにより、感度よく検出できた。同位体希釈法により0.02－2 ng/mLの範囲で作成した検量線は、いずれも相関係数0.998以上と良好な直線性を示し、検出限界も3－22 pg/mLで直接注入法より27倍以上の感度を示した。
3 本法を用いて、非喫煙及び喫煙者の尿試料分析に適用した結果、添加回収率も良好で、再現性よく定量でき、非喫煙者に比べ喫煙者の尿中に8-IPや8-OHdGが高濃度で検出されたことから、喫煙による酸化ストレスの影響評価法として有用であることがわかった。
本研究は、SPME法による効率的な抽出濃縮、LC－MS/MS法との連携による選択的高感度な分析が可能であり、DNAや脂質、蛋白質の酸化損傷のマルチバイオマーカー解析による健康影響評価や疾病診断などへの応用が期待される。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
インチューブSPME／LC－MS/MS法による高感度なオンライン自動分析システムを開発する初期目標は達成されたが、マンパワー不足と装置の不具合で様々な試料への展開が不十分である。また、輸入試薬の手配入手遅れにより、免疫測定法との比較は現在進行中である。しかし、研究成果の一部は、学会発表と論文公表を行った。
|
| Strategy for Future Research Activity |
本年度が研究計画の2年目であり、初年度計画で目標が十分達成できなかった様々な生体試料への応用については、現在唾液・毛髪試料への適用を検討している。また、本年度は、新たに老化／疲労・ストレス、飲酒・飲食、運動による健康影響評価や抗酸化機能食品の摂取の効果解析などに本手法を応用して、その有効性を検証するとともに、酸化ストレス負荷とマルチマーカーレベルの解析、機能性食品及び候補食品摂取によるマルチマーカーレベルから抗酸化機能を探索する手法を開発する予定である。
|
| Causes of Carryover |
当該年度の当初計画が、「現在までの達成度」に記載した理由により、やや遅れてしまったため、その分に使用する予定の予算が次年度使用額として生じた。
|
| Expenditure Plan for Carryover Budget |
唾液や毛髪などの生体試料サンプリング及び前処理に必要な器具類の購入に使用する予定である。
|
